エバネッセント顕微鏡を用いたインスリン開口放出の分子機構研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14570130
• Research Institution: Kyorin University
• Principal Investigator: 今泉 美佳 杏林大学, 医学部, 助手 (40201941)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 永松 信哉 杏林大学, 医学部, 教授 (80231489)
• Keywords: インスリン / 開口放出 / 膵β細胞 / エバネッセント顕微鏡 / 分泌顆粒 / 2型糖尿病

Research Abstract

本研究では、ヒトインスリンのC末端にGFPを融合したキメラ蛋白質を初代培養膵β細胞およびMIN6β細胞に発現させることでインスリン穎粒を標識し、エバネッセント顕微鏡下で顆粒の供給、docking、fusionをリアルタイムでかつ単一顆粒レベルで画像解析し、以下の点を明らかにした。
(1)インスリン分泌穎粒は予め、形質膜にdockingしており、高カリウム刺激により予めdockingしている顆粒と形質膜のfusion(300ms以内)が観察された。一方、高グルコース刺激を行うと、初めの120s間は予めdockingしている顆粒(previously docked granules)からのfusionが見られ(第1相)、その後は主に刺激後新たに供給され、形質膜上にdockingした顆粒(newly recruited granules)からのfusionが10min以上にわたって観察され(第2相)、グルコース刺激に対する2相性インスリン分泌を単一顆粒レベルで明らかにすることができた。
(2)2相性インスリン分泌におけるSNARE complexの役割を明らかにするために、syntaxin SNARE motif(H3 domain)とTAT蛋白との融合蛋白(TAT-H3)を作成し、これを導入したMIN6β細胞にグルコース刺激を行い、エバネッセント顕微鏡下でインスリン開口放出を単一顆粒レベルで画像解析した。TAT-H3導入細胞では、インスリンfusionの数が阻害され、1)第1相ではpreviously docked granulesのfusionが抑制され、2)第2相ではnewly recruited granulesのdocking数が大きく減少していた。これらの結果より、インスリン分泌第1相、第2相に対してSNARE complexが異なる形式で関与していることが明らかとなり、第1相、第2相においてインスリン開口放出機構が異なる可能性が示唆された。

Research Products

• [Publications] Taraska J.W., Ohara-Imaizumi M: "Secretory granules are recaptured largely intact after stimulated exocytosis in cultured endocrine cells"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100. 2070-2075 (2003)
• [Publications] Nakamichi Y., Ohara-Imaizumi M., Ishida H., Nagamatsu S.: "An Insulin-related peptide expressed in response to exogenous insulin, which augments the inuslin-stimulated glucose uptake"J. Cell Sci.. 116. 73-79 (2003)
• [Publications] Ohara-Imaizumi M., Nakamichi Y., Nishiwaki C., Nagamatsu S.: "Transduction of MIN6 β cell with TAT-Syntaxin SNARE Motif Inhibits Insulin Exocytosis in Biphasic Insulin Release in a Distinct Mechanism Analyzed by Evanescent Wave Microscopy"J. Biol. Chem.. 277. 50805-50811 (2002)
• [Publications] Ohara-Imaizumi M., Nagamatsu S.(他4名): "Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic β cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin)and confocal laser microscopy"Biochem. J.. 363. 73-80 (2002)
• [Publications] Ohara-Imaizumi M, Nagamatsu S.(他3名): "Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy"J. Biol. Chem.. 77. 3805-3808 (2002)
• [Publications] 永松信哉, 今泉美佳: "インスリン開口放出機構とSNARE蛋白質"日本臨床. 60. 213-218 (2002)
• [Publications] 今泉美佳, 永松信哉: "インスリン開口放出の可視化(ミニレビュー)"生化学. 75. 49-54 (2003)