成体肝幹様細胞の分化特異的発現遺伝子のcDNA Subtraction法での解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14570178
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 加野 准子 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (60334059)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野口 雅之 筑波大学, 基礎医学系, 教授 (00198582)
• Keywords: 肝臓 / 幹細胞 / 分化 / 特異的発現遺伝子

Research Abstract

本研究は成体肝臓に存在する幹細胞様細胞を用い、Laser Capture Microdissection (LCM), RNA増幅(T7 Adapter Ligation PCR Amplification, TALPAT法)とcDNA Subtraction法によってその分化特異的発現遺伝子を網羅的に探索することを可能にし、それらの遺伝子解析から肝幹細胞分化の分化機序を模索することを目的とする。本研究では当研究室で分離、樹立した成体肝幹細胞様細胞株培養系を用いた解析を試みた。この培養系はsingle cell cloneの培養系であるが、自発的な表現型の変化が示唆されるため、厳密な解析のためには幹細胞様細胞コロニーに限局して遺伝子を抽出する必要があった。そこでLCMを用い幹細胞様細胞コロニーを選択的に採取し、totalRNAを抽出した。抽出した微量totalRNAから網羅的発現遺伝子解析を可能にするため、TALPAT法によりmRNAを増幅した。同様にTALPAT法で増幅した肝実質細胞mRNAとこのサンプル間でSupression Subtractive Hybrydizationを行い幹細胞様細胞特異的発見遺伝子が増幅できた。増幅した遺伝子に対し、TA Cloning, Differential Screeningを施行し39個の解析候補幹細胞様細胞特異的発現遺伝子を得た。現在これらの遺伝子配列の解析が進行中であり、胎児期と新生児期に関与すると考えられる興味深い遺伝子も同定されている。
今後はこれらの遺伝子群に関し、他の肝幹細胞様細胞での発現を定量的Real time RT-PCRで確認すること、成体ブタ肝組織とヒト正常肝、肝腫瘍を含む肝疾患病理標本を用いIn situ hybridizationによりその発現解析を行う予定である。