マイクロアレー技術を応用した実験的除神経筋の発現遺伝子の系統的解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14570619
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 自見 隆弘 昭和大学, 医学部, 助教授 (30196654)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原 一 昭和大学, 医学部, 助教授 (30241029) ; 渋谷 誠二 昭和大学, 医学部, 講師 (80167444) ; 若山 吉弘 昭和大学, 医学部, 教授 (40138467) ; 井上 昌彦 昭和大学, 医学部, 助手 (50286770)
• Keywords: 除神経 / 骨格筋 / マイクロビーズ / DNAアレイ / 遺伝子発現

Research Abstract

骨格金の機能維持には神経支配が必要である。しかし、どのような蛋白質(遺伝子)がそれに必要かについての系統的解析はほとんど行われていないので、本年度は3年計画の1年目として以下の研究を行った。
1.ラット除神経筋の作成
10週齢のウイスターラットの片側坐骨神経を切断し、72時間後に支配筋である長趾伸筋を摘出した。
2.mRNAの抽出
Trizol(Gibco BRL)を用いて全RNAを抽出し、次いでpoly(A)+RNAを調製した。
3.マイクロビーズアレー技術による正常筋・除神経筋間での差異発現遺伝子群の単離(クイックソート)
DNAマイクロビーズアレー技術を用いて差異遺伝子群の分離を試みた。概要は以下の通りである。
1)抽出・精製した正常筋・除神経筋のmRNAをcDNAに変換後、正常筋、除神経筋で異なる蛍光色素を標識した1本鎖cDNAプローブ(正常筋-Cy5、除神経筋-fluorescein)を調製した。
2)ラット骨格筋DNA Pre-madeマイクロビーズに対し、1)で調整したプローブを競合ハイブリダイゼーションさせた。
3)競合ハイブリダイゼーションを行ったマイクロビーズをセルソーターにかけ、2種類の蛍光色素のシグナル強度の異なっている部分にゲートをかけビーズを分取した。これにより、正常筋と除神経筋で発現量の異なる遺伝子(cDNA)の結合したマイクロビーズが単離された。
4)マイクロビーズには、あらかじめcDNAの末端にPCRプライマーにアニーリングする配列を持つアダプターを結合おり、これを用いてPCRを行い、2群間で発現量の異なるcDNAの塩基配列を決定した。
なお、クイックソートについてはタカラバイオ(株)に解析受託して行った。
今後、クイックソートで得られたクローンを利用し、マイクロアレー解析など行う予定である。