肝臓へのミオグロビン遺伝子導入:肝移植での臓器障害の克服

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571139
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 本田 和男 愛媛大学, 医学部, 助教授 (00209321)
• Keywords: 肝臓 / 遺伝子導入 / ミオグロビン / 阻血

Research Abstract

移植肝にあらかじめ酸素のリザーバーとしてミオグロビン遺伝子を導入し発現させておき、阻血状態、臓器保存状態での肝障害の肝臓の保護効果を動物実験で検討することを目的とした。
293細胞を継代培養し、ミオグロビン遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを感染させ、徐々にスケールアップして大量培養として回収し、超遠心分離と透析で精製分離した。ミオグロビン遺伝子の発現を確認するため培養肝細胞Hep3Bに感染させmRNAを抽出し、ミオグロビン遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行い、このベクターによる培養肝細胞におけるミオグロビン遺伝子の発現を確認した。精製したミオグロビンアデノウイルスをマウスの尾静脈より投与し、3日後肝組織を採取してmRNAを抽出しミオグロビン遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行った。肝組織でのミオグロビン遺伝子の発現が確認された。
肝移植臓器障害モデル作成のため、C57BLマウスを麻酔下に開腹し肝十二指腸靭帯のクランプによるプリングルの操作を加え、24時間後肝組織標本を採取しDNAを抽出しアガロース電気泳動にて、アポトーシスによるDNAラダーを検出した。また組織標本のTUNEL染色を行い肝細胞にアポトーシスを認めた。またアポトーシスに関与するbcl-XL, bcl-2,Baxの発現を評価するため免疫染色を行ったが有意差は認めなかった。今後リアルタイムPCRなどのより定量性のある方法でさらに評価する予定である。またin vivoでの保護効果をさらに検討する。