アポトーシス実行因子Caspase3を用いたp53不活化腫瘍の選択的遺伝子治療

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571217
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 篠田 憲幸 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (80305549)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤井 義敬 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40156831) ; 桑原 義之 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 講師 (90225326)
• Keywords: Caspase3 / apoptosis / XIAP / 抗がん剤治療 / VP16

Research Abstract

本研究はp53が変異、失活した腫瘍細胞でのみCaspase3が活性化されるシステムを考案し、腫瘍選択性、抗腫瘍効果の向上を目的としている。現在までの研究実績としては、まずCaspase3のCDNAををPCR法を用いて増幅し、哺乳類発現ベクターであるpcDNA3.1にクローニングした。さらに、p53の標的遺伝子であるp53AIP1の遺伝子座からp53結合配列を単離し、ルシフェラーゼアッセイ用pGL3ベクターヘクローニングした。このベクターを、すでにクローニングしてあったp53を発現するベクターとヒト線維芽細胞の正常細胞株NHDFへダブルトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性の上昇を確認した。
このベクターにp53が結合し、下流の遺伝子の発現させることが証明されたため、このルシフェラーゼの組み込まれた部位を制限酵素にてダイジェストし、XIAP遺伝子へと組み換えした。正常細胞(野生型p53)へ導入するとXIAP遺伝子の発現が上昇することを確認した。さらに変異型p53をもつ大腸癌細胞株SW480を用い、このXIAPベクターを導入したが、発現の上昇は認めなかった。
Caspase3を大腸癌細胞株へ導入しVP16存在下で、培養すると活性型のCaspase3が誘導されるのを確認した。さらに、この細胞は4日後には細胞死し、FACS解析でアポトーシスが確認された。
今後は、これらのベクターを用い、1.正常細胞株および野生型p53をもつ癌細胞株にVP16存在下において、XIAPベクターとCaspase3の発現ベクターを同時に導入し、アポトーシスを回避できるかどうか?2.変異型p53をもつ細胞株において同様な実験をした場合、アポトーシスが誘導されるかどうかの検討を行う予定である。