虚血性神経細胞死におけるユビキチン化蛋白質蓄積の意義に関する研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571336
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 高田 耕司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教授 (30179452)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 塩田 清二 昭和大学, 医学部, 教授 (80102375)
• Keywords: ユビキチン / 脳虚血 / 神経細胞死 / アフィニティー精製 / 免疫沈降 / 蛋白分解 / ユビキチン化蛋白質

Research Abstract

ユビキチン化蛋白質精製のため、一過性中大脳動脈閉塞マウス(片側虚血1時間、再灌流6時間)および正常マウスの大脳皮質組織、各3〜4g生重から、トリス緩衝液で抽出した水溶性画分とその不溶成分を8M尿素で可溶化した尿素溶性画分を調製した。後者は高濃度尿素による抗原抗体反応の阻害を防ぐためその後4M尿素溶媒に透析した。各画分(100〜250mg蛋白含有)を抗ユビキチンFK2抗体カラム(5ml)でアフィニティー精製したところ、何れも蛋白量は0.5%以下に減じたがELISA定量マルチュビキチン鎖はほぼ100%回収され効率的な精製が達成された。
虚血ストレスで増加するユビキチン化蛋白質は高分子量(約40kDa以上)で非水溶性尿素溶性を示すため、該当画分の精製標品からゲル濾過で高分子量成分を得た。これをendoproteinase Asp-Nで消化後、"ユビキチンC末端断片D58-G76(UCP)"を認識するUC1抗体を用いた免疫沈降に供した。沈降ペプチド群を逆相HPLCで分離し自動化エドマン分解で解析した結果、次の4群が見出された。(1)K48型マルチユビキチン鎖由来UCP-ユビキチン断片複合体、(2)ユビキチン化蛋白質由来UCP-ペプチド断片複合体、(3)UCPおよびUCP-X、(4)ユビキチンN末端領域ペプチド。また、虚血脳、および正常脳に特有の(2)成分として、前者ではcyclin-dependent kinase5(Cdk5)等、後者ではhistone H2A等の断片が同定された。さらに虚血脳の(1)量は多く、対照脳の約2.5倍に相当した。これらの結果から、脳虚血ストレスによりCdk5等の標的蛋白がK48鎖型のユビキチン化を受け蓄積したと推定される。
今後、同定された標的蛋白候補のユビキチン化機構の解析と未同定成分の単離を進める計画である。

Research Products

• [Publications] Takagi, M., Yamauchi, M., Takada, K., Ohkawa, K.: "Serum ubiquitin-protein conjugates in normal subjects and patients with alcoholic liver diseases : immunoaffinity isolation and electrophoretic mobility"Alcohol. Clin. Exp. Res.. 26. 1692-1696 (2002)
• [Publications] Dohi, K., Mizushima, H., Nakano, S., Mustang, M., Shioda, S.: "Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) prevents hippocampal neurons from apoptosis by inhibiting Jun N-terminal kinase (JNK)/stress activated protein kinase (SAPK) and p38 signal transduction pathway"Regul. Pept.. 109. 83-88 (2002)
• [Publications] Mizushima, H., Zhou, C., Dohi, K., Matsumoto, H., Horai, R., Asano, M., Iwakura, Y., Hirabayashi, T., Arata, S., Nakajo, S., Yada, T., Takaki, A., Shioda: "Reduced postischemic hippocampal apoptosis in mice deficient interleukin-1"J. Comp. Neurol.. 448. 203-216 (2002)
• [Publications] Ohtaki, H., Funahashi, H., Mizushima, H., Ogawa, A., Maeda, M., Oguro, T., Horai, R., Asano, M., Iwakura, Y., Goto, N., Shioda, S.: "Reduction of focal ischemic brain injury via the suppression of peroxynitrite formation in mice deficient in ineterlerukin-1"Neurosci. Res.. (in press). (2003)