皮膚悪性腫瘍発生における転写因子Basonuclinの関与

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571724
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 松崎 恭一 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (20278013)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 肇 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (60193603)
• Keywords: Basonuclin / 皮膚 / 悪性腫瘍 / 発癌 / 増殖 / 分化 / Zinc finger / Transcription factor

Research Abstract

1.皮膚癌の作製
Hairless mouseの背部に東芝FL-20SEランプを用いて0.300mW/cm^2のUVBを照射した。皮膚癌形成部と、前癌病変部として皮膚肥厚部を採取した。また、コントロールとしてUVBを照射していない皮膚も採取した。採取した検体をO.C.T.に入れ、急速凍結した。
2.免疫組織染色
採取した検体をO.C.T.Compound (Tissue Tek^R, SAKURA)に入れ、急速凍結後、6μmの凍結切片を作製した。次に-20℃のアセトン・メタノール(1:1)で15分間固定した後、二次抗体によるアーチファクトを最小限にするためavidin/biotinblocking kit^R (Vector Laboratories, USA)を使用した。Basonuclin抗体はRabbit polyclonal anti-human Basonuclinを使用した。この抗体を5%牛胎児血清アルブミン一等張性リン酸緩衝液(5%BSA-PBS)で100倍に希釈後、4℃で一晩検体をインキュベーションした。次に、5%BSA-PBSで20,000倍に希釈したGoat anti-Rabbit IgG-Biotin (Pierce Chemical Co., USA)で室温で1時間インキュベーションした。さらに5%BSA-PBSで10,000倍に希釈したStreptavidin-Cy3 (Pierce Chemical Co., USA)で室温で1時間インキュベーションした。各染色間には0.1%NP40-PBSで3回洗浄した。さらに1μg/mlのHoechst 33258 (Fluka, USA)で5分間インキュベーションを行いDNAを染色後、螢光顕微鏡で観察した。
3.結果
コントロールでは表皮基底層で淡くbasonuclinが染色がされた。前癌病変部では肥厚した表皮の基底層とその直上の数層でbasonuclinの濃染がみられた。皮膚癌形成部では腫瘍細胞がbasonuclinで濃染された。