分泌蛋白の細胞内プロセシングの免疫電顕法による解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571753
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 倉淵 真悟 日本歯科大学, 歯学部, 助教授 (90170076)
• Keywords: プロレニン / レニン / プロセシング / 免疫組織化学 / 電顕免疫組織化学 / 顆粒性導管 / 顎下線 / マウス

Research Abstract

Pratt et al.(1983,1987)によると、腎臓プロレニン、Ren 1 rerinのプロセシングとは異なり、顎下腺プロレニン、Ren 2 reninの限定切断は細胞内で短時間うちに完了し細胞内で活性型レニンができる。しかも多くの切断部位がありプロセシング複雑である。本年度はプロレニンのみを認識し、活性型レニンを認識しない抗体を得るために次の研究成果を得た。
1)、マウス顎下腺プロレニン、Ren 2 reninの全アミノ酸配列(Panthier et al.,1982;Misono et al.,1982)に基づき、切断される部位を同定しその部位をまたぐような短いペプチド(親水性でしかも他の活性物質と相同性の低い領域)をデザインした。プロレニンの場合、切断箇所は3箇所(Cys^<18>↓^<(1)>Thr^<19>、Arg^<63>↓^<(2)>Ser^<64>、Arg^<353>↓^<(3)>Asp^<354>、切断(1)はシグナルペプチドの除去、(2)〜(3)がactive A chain、(3)以降がB chainである)個々の切断部位をまたぐ短いペプチドを合成することによって、前駆体のみを特異的に認識する抗体の作成が理論的には可能である。遺伝子・蛋白質配列解析ソフトウエア(DNASIS、Mac Molly、Mac Vector)でコンピュータ解析し、それら3つの切断部位に相当する数個のペプチドをデザインした。
2)、ペプチド合成については静岡大学理学部に設備されているペプチド合成装置を使用した。この研究は生物地球環境科学科、生物機能科学講座の田中滋康教授との共同研究の一貫である。
3)、現在、作成したそれぞれのペプチドを抗原としてウサギに免疫しポリクローナル抗体を作成している。それに伴い、得られた抗体の特異性を検討するためのウエスタンブロッティング法の準備を並行して進めている。

Research Products

• [Publications] Shingo Kurabuchi: "Morphologic changes in the glandular convoluted tubule cells of the mouse submandibular gland following hypophysectomy and hormonal repalcement"Odontology. 90. 27-34 (2002)
• [Publications] Kurabuchi S, Tanaka S: "Immunocytochemical localization of prohormone convertases PC1 and PC2 in the mouse thyroid gland and respiratory tract"J Histochemistry & Cytochemistry. 50(7). 903-909 (2002)
• [Publications] Kurabuchi S, Hosoi K, Gresik EW: "Multihormonal regulation of granular convolfcuted tubule cells expressing mK1, a true tissue kallikrein, in the mouse sublingual gland"Proceedings of the 21st Conference of Europian Comparative Endocrinoiogists, International Proceedings Division. 527-530 (2002)