リアルタイム定量PCRを利用したプラーク内の齲蝕関連菌の層別分布に関する研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571974
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 加藤 一夫 愛知学院大学, 歯学部, 助教授 (60183266)
• Keywords: 歯垢 / 齲蝕関連菌 / 層別分布 / polymerase chain reaction

Research Abstract

この研究目的は、切片の作製を利用した歯垢の層別採取技術とリアルタイム定量PCRによる齲蝕関連菌(S.mutansとS.sobrinus)の検出法を組み合わせ、新たな齲蝕リスクの評価指標となりうる歯垢内の細菌密度分布を解析する方法を開発することであった。今年度は、試料分画からの齲蝕関連菌の検出方法と、歯垢の層別構造と関連した細菌叢に関する情報の有用性を、従来の定性的なPCR分析から検討した。主な知見を以下に示す
(1)PCR分析用試料分画の調整方法の確立
歯垢採取装置に堆積させた試料を、直ちに凍結乾燥、methacrylateで包埋した後、ウルトラミクロトームで表面から内部に向かって切片化し層別分画に分離した。クロロホルム処理により、methacrylateを除去したものは、市販の核酸精製試薬(インスタジーンマトリックスキット,BioRad)でPCR分析用のgenomic DNAが抽出できることを確認した。
(2)歯垢の層別試料とPCR分析法のマッチングの検討
試料分画から、菌種特異的なプライマーで齲蝕関連菌を直接検出すると、歯垢のもつ多様な不純物がノイズとなって検出感度が低下した。検出感度を高めるために、2段階で増幅を計るnested PCRを用いたところ良好な結果が得られたため、リアルタイム定量PCRに進むための予備的検討に用いた。
(3)8名の被験者による歯垢内の齲蝕関連菌を層別分布
歯垢を8〜10層に分離しS.mutansとS.sobrinusの分布を比較したところ、S.mutansはS.sobrinusより広範に検出された。同時に、菌の検出は歯垢の表〜中層で多く、その検出範囲やパターンには大きな個人差が認められた。このような歯垢の層別構造と関連した細菌叢に関する情報は、これまで報告がなく、個人の微生物因子における齲蝕リスクの評価や、殺菌剤の効果判定などに有用と考えられた。