自家歯周組織由来細胞凝集塊の再生療法応用への基礎的研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571991
• Research Institution: Kanagawa Dental College
• Principal Investigator: 出口 眞二 神奈川歯科大学, 歯学部, 教授 (60121018)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 光家 由紀子 神奈川歯科大学, 歯学部, 助手 (10339781) ; 伊海 博之 神奈川歯科大学, 歯学部, 講師 (80277904) ; 菅谷 彰 神奈川歯科大学, 歯学部, 助教授 (30162853)
• Keywords: 歯周組織由来細胞 / 再生 / スフェロイド / 細胞増殖

Research Abstract

歯周組織再生療法であるGTR法が臨床応用へ開発され、適応症を限定することにより、理想的な治癒を確立することが可能になった。しかし、歯周外科処置を必要とする症例は1壁性骨欠損のような条件の不利な症例が多い。また、他家、他種より採取された生体材料を再生療法に用いた場合、供給側からの伝達性病原体、細菌およびウィルスの受容側への移入の危険性を全面否定することはできない。現在まで我々は、歯根膜由来線維芽細胞の細胞凝集塊(スフェロイド)の作製に成功している。スフェロイドは細胞が3次元形態で細胞集団をなし、球型の形態を有し、スフェロイド内の細胞は分裂、増殖能を保持している。この3次元形態を有するスフェロイドを歯周組織の再生に応用するため、今年度はヒト歯槽骨由来線維芽細胞の無血清培地による細胞培養法の確立を主目的とした。
継代7代目のヒト歯槽骨由来線維芽細胞をマイクロプレートに1.8×10^4/cm^2の濃度で播種し、D-MEM/F-12(0%FCS)100μl加え培養を行った。培養24時間後、Asc-2Pを各々0.25,0.5,1,2mmolに調整したD-MEM/F-12(0%FCS)に成長因子無添加群、rhPDGF添加群、rhPDGF・rhb-FGF添加群で各々培地を交換し、更に1,3,7日間培養を行った。また、細胞増殖活性測定にはWST-1を使用した。すなわち、培養1,3,7日目の培地を100μlのD-MEM/F-12(0%FCS)に交換し、WST-1を10μl加え、90分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定した。マイクロプレートマネージャーIII/Macintoshを使用して450nmにおける吸光度を測定し,細胞増殖活性の値とした。
その結果、7日目の細胞数は各群ともにAsc-2Pの1mmol添加が他の添加濃度と比較して最高値を示した。また、D-MEM/F-2(0%FCS)rhPDGF・rhb-FGF添加群で最大値0.876±0.142はD-MEM/F-12(5%FCS)1.199±0.098の73%を示した。今後、培養期間と細胞の初期播種濃度を高め、コンフルエントの状態を確立しスフェロイドを作成する予定である。

Research Products

• [Publications] Hiroyuki Ikai, Toshiyuki Tamura, Shinji Deguchi et al.: "Low intensity pulsed ultrasound accelerates periodontal wound healing after flap surgery"The Bulletin of Kanagawa Dental College. 31・2. 93-95 (2002)
• [Publications] 田胡和浩, 光家由紀子, 出口眞二: "ヒト歯肉由来線維芽細胞培養上清中のヒト補体Clr前駆体はヒト歯根膜由来線維芽細胞の走化性因子である"神奈川歯学. 37・1. 1-9 (2002)
• [Publications] Akira Sugaya, Nobumichi Mogi, Shinji Deguchi et al.: "Experimental diabetes accelerates accumulation of fluorescent pigments in rat trigeminal neurons"Brain Research. 999. 132-134 (2004)