転写初期反応におけるmRNAキャッピング酵素の役割

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14580630
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 柴垣 芳夫 北里大学, 薬学部, 講師 (90235565)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水本 清久 北里大学, 薬学部, 教授 (80092344) ; 久武 幸司 埼玉医科大学, 医学部, 助教授 (70271236)
• Keywords: キャッピング酵素 / キャップ構造 / in vitro転写反応 / リン酸化CTD / 転写開始反応

Research Abstract

(1)キャッピング酵素の転写反応への関与-キャッピングの時期の決定(柴垣)
転写される領域に一定の間隔をおいてC残基を挿入した特殊な鋳型DNA(C-less cassette)を作成ビオチン化し、アビジンを結合させたマグネチックビーズに固定化し、固定化鋳型DNAを作成した。HeLa細胞核抽出液を用いたin vitro転写系に固定化鋳型DNAを加え、転写開始複合体を形成させた。転写開始複合体を穏和な条件で洗浄して分離後、精製キャッピング酵素を添加し、CTP非添加の条件で転写反応を行わせたところ、転写産物には転写と共役してキャップ構造が付加された。そこでキャップ構造がどの時点で転写産物に付加されるのかを調べる目的で、様々な長さのRNA鎖が合成できる鋳型DNAを作成し、転写・キャッピング反応を行った結果、RNA鎖が16〜17nt伸長した時点でキャップの付加が見られた。現在、キャップが付加される前後で転写伸長複合体にどのような変化があるのか、western bottingを用いて検討している。
(2)RNA polymerase IIのリン酸化とキャッピング酵素活性(柴垣、久武)
キャッピング酵素とRNA polymerase IIの相互作用を調べる目的で、子牛胸腺より、RNA polymerase IIを高度に精製した。精製したRNA polymerase IIをキャッピング反応系に添加しキャッピング酵素活性に与える影響を調べた結果、CTDをリン酸化していないRNA polymerase IIを添加したのみで、キャッピング効率は約3倍上昇した。さらに、RNA polymerase IIをCTD kinaseの一つであるCAKによってリン酸化すると、リン酸化していないときに比べ約2倍にキャッピング活性が上昇した。このことは、キャッピング酵素が転写の各段階でCTDのリン酸化状態によって活性が制御されている可能性を示唆するものである。現在他の様々なCTD kinaseによってリン酸化されたRNA polymerase IIがキャッピング活性にどのような影響を与えるのか検討中である。

Research Products

• [Publications] 柴垣芳夫: "Involvement of mRNA capping enzyme in transcription initiation"生化学. 75. 939 (2003)
• [Publications] 松井博紀: "RNA polymerase II転写初期反応におけるmRNAキャッピング酵素の役割"第26回日本分子生物学会年会講演要旨集. 851 (2003)
• [Publications] 和田京子: "mRNAキャッピング酵素とRNA polymerase IIの相互作用"第26回日本分子生物学会年会講演要旨集. 852 (2003)
• [Publications] 久武幸司: "TFIIHのヘリカー背とキナーゼ活性の機能解析"第26回日本分子生物学会年会講演要旨集. 391 (2003)
• [Publications] Yoshio Shibagaki: "Involvement of mRNA capping enzyme in transcription initiation"Abstracts of RNA 2003 KYOTO "The New Frontier of RNA Science". 175 (2003)