新規コレステロール結合プローブを用いた膜機能ドメイン(ラフト)の分子基盤の解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14580633
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology
• Principal Investigator: 岩下 淑子 (財)東京都高齢者研究・福祉振興財団, 東京都老人総合研究所・生体膜機能研究グループ, グループリーダー(研究職) (50111498)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 猪股 光司 (財)東京都高齢者研究, 福祉振興財団・東京都老人総合研究所・生体膜機能研究グループ, 主任研究員 (30142649)
• Keywords: コレステロール / ラフト / コレステロール結合毒素 / 脂質ミクロドメイン / T細胞

Research Abstract

我々は、これまでに、コレステロールに特異的に結合する毒素(θ毒素)を改変、無毒化することによってコレステロールに特異的なプローブ(BCθ)を作製し、BCθが脂質ミクロドメイン(ラフト)中のコレステロール密度の高い領域に選択的に結合することを見いだしている。従来、ラフトの生化学的解析には、界面活性剤に不溶性の低密度膜画分が「ラフト画分」として用いられてきた。しかし、我々は、BCθを用いた電子顕微鏡による観察から、「ラフト画分」にはコレステロールに富む膜とそうでないものが混在していることを見出している。すなわち、組成の異なるラフトサブセットの存在、あるいは、ラフトとは特徴づけられない膜成分の混在を示すものと考えられる。そこで、BCθを用いたアフィニティ精製を行い、「ラフト画分」からコレステロールに富む膜を分離する試みを行った。まず、ビオチニル化したプローブ(BCθ)を結合させたT細胞(Jurkat細胞)から「ラフト画分」を調製した。次に、この画分にアビジンを結合させた坦体を加え、BCθを結合した膜断片のみを坦体に吸着させて分離した。吸着画分の膜断片のコレステロール含有量は非吸着画分に比べて有意に高いことが確認された。さらに、ラフトマーカーといわれているフロチリンや、Lck, FynなどのSrcファミリーチロシンキナーゼ類およびガンダリオシドGM1がかなりの割合で吸着画分に回収された。一方、「ラフト画分」中の分子のうち、T細胞の活性化に関与するZAP70、CD3や細胞膜裏打ち蛋白質であるエズリンは全く吸着画分には検出されなかった。このことから、Lck, Fyn等の情報伝達分子やフロチリンなど、「ラフト画分」中の特定の分子群がコレステロールに富む膜領域に局在することが強く示唆された。

Research Products

• [Publications] Shimada, Y. et al.: "The C-terminal domain of perfringolysin O is an essential cholestereol-binding unit targeting to cholesterol-rich microdomains"Eur. J. Biochem.. 269(24). 6195-6203 (2002)
• [Publications] Terashita, A. et al.: "Lipid binding activity of a neuron-specific protein NAP-22 studied in vivo and in vitro"J. Neurosci. Res.. 70(2). 172-179 (2002)
• [Publications] Kokubo, H. et al.: "Ultrastructural localization of flotillin-1 to cholesterol-rich membrane microdomains, rafts, in rat brain tissue"Brain Res.. 965(1-2). 83-90 (2003)
• [Publications] 嶋田有紀子, 岩下淑子: "コレステロールから視た膜機能ドメイン-コレステロールを見分けるプローブの開発"生化学. 74(7). 547-551 (2002)