2003 Fiscal Year Annual Research Report

硫黄酸化細菌のNAD依存型イソクエン酸脱水素酵素の構造と機能の精密解析

Research Project

Project/Area Number	14580648
Research Institution	Okayama University
Principal Investigator	稲垣賢二岡山大学, 農学部, 教授 (80184711)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田村隆岡山大学, 農学部, 助教授 (40253009) 今田勝巳大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 助教授 (40346143) 田中英彦岡山大学, 農学部, 教授 (90065912)
Keywords	イソクエン酸脱水素酵素 / 硫黄酸化細菌 / Acidithiobacillus thiooxidans / NAD^+ / X線結晶構造解析
Research Abstract	イソクエン酸脱水素酵素(ICDH)は多くの生物から単離されており,細菌由来のICDHのほとんどは補酵素としてNADP^+を要求する.これに対し,我々が見出した化学合成独立栄養細菌Acidithiobatillus thiooxidans由来のICDHはNAD^+依存型である.また本酵素はアミノ酸配列や反応機構など細菌由来の3-イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素(IPMDH)と類似している.本酵素の結晶構造解析を行いNADP^+依存型ICDH,及びIPMDHとの比較検討を行うことにより,基質認識機構,補酵素認識機構の解明に役立つと思われる.そこで今年度は本酵素の結晶構造解析を行った. まずICDH大量発現プラスミドpKKICDHを用いて大量精製を行った.酵素精製は熱処理60℃,5minの後,DEAE-ToyopearlとSephacryl S-200HRの二つのカラムに供する事で行った.電気泳動により単一に精製されていることが確認されたので,この精製酵素を用いて結晶化を行った.その結果,ICDH-NAD^+複合体の状態で,四角両錐の結晶が得られた.この結晶は,空間群P4_32_12,格子定数a=b=125.99Å,C=268.35Åのパラメーターを持つ。Os置換体を用いて位相を決定し、分解能1.9Åでの精密化を進めている。また,この解析により,ニコチンアミドのリボースの酸素がThr105の主鎖に配位,固定されており,このためC-dループの構造がNADP型ICDHと大きく異なっていることがわかった.一方,基質特異性の検討のため,活性中心のSerをGluに置き換える部位特異的変異を行い,変異酵素pKKICDH-S113Eを作成し,酵素精製及びイソクエン酸に対するKm値を求めた.その結果,野生型酵素と比べて比活性が0.8%に低下し,Km値は40倍に増加した。今後はさらに解析を進めて,補酵素及び基質の認識機構の全容を明らかにする予定である。

Research Products

(5 results)

All Other

All Publications (5 results)

[Publications] Tamura, T., Sawamoto, Y., Kuriyama, T., Oba, K., Tanaka, H., Inagaki, K: "Cosynthesis of monofluoroacetate and 4-flouorothreonine by resting cells of blocked mutants of Streptomyces cattleya NRRL8057"J.Mol.Catal.B. 23. 257-263 (2003)
[Publications] Inoue, H., Nishito, A..Eriguchi.S., Tamura, T., Inagaki, K., Tanaka, H: "Purification and substrate characterization of α-Ketobutyrate decarboxylase from Pseudomonas putida"J.Mol.Catal.B. 23. 265-271 (2003)
[Publications] Arima, J., Tamura, T., Kusakabe, H., Asiuchi, M., Yagi, T., Tanaka.H., Inagaki, K: "Recombinant expression, biochemical characterization and stabilization by proteolysis of an L-glutamate oxidase from Streptomyces sp.X-119-6"J.Biochem. 134. 805-812 (2003)
[Publications] Takakura, T., Akita, K., Takimoto, A., Inagaki, K., Esaki, N., Soda, K., Mitsushima, K: "Quantitative measurement of L-methionine γ-lyase in activity in the presence of L-methionine was approached from progress curve analysis"Anal.Biochem.. (in press). (2004)
[Publications] Hayashi F., Suzuki H., Iwase R., Uzumaki T., Miyake A., Shen JR., Imada K., et al.: "ATP-induced hexameric ring structure of the cyanobacterial circadian clock protein Kai C"Genes Cells. 8. 287-96 (2003)

2003 Fiscal Year Annual Research Report

硫黄酸化細菌のNAD依存型イソクエン酸脱水素酵素の構造と機能の精密解析

Principal Investigator

稲垣 賢二 岡山大学, 農学部, 教授 (80184711)

Research Products

[Publications] Tamura, T., Sawamoto, Y., Kuriyama, T., Oba, K., Tanaka, H., Inagaki, K: "Cosynthesis of monofluoroacetate and 4-flouorothreonine by resting cells of blocked mutants of Streptomyces cattleya NRRL8057"J.Mol.Catal.B. 23. 257-263 (2003)

[Publications] Inoue, H., Nishito, A..Eriguchi.S., Tamura, T., Inagaki, K., Tanaka, H: "Purification and substrate characterization of α-Ketobutyrate decarboxylase from Pseudomonas putida"J.Mol.Catal.B. 23. 265-271 (2003)

[Publications] Arima, J., Tamura, T., Kusakabe, H., Asiuchi, M., Yagi, T., Tanaka.H., Inagaki, K: "Recombinant expression, biochemical characterization and stabilization by proteolysis of an L-glutamate oxidase from Streptomyces sp.X-119-6"J.Biochem. 134. 805-812 (2003)

[Publications] Takakura, T., Akita, K., Takimoto, A., Inagaki, K., Esaki, N., Soda, K., Mitsushima, K: "Quantitative measurement of L-methionine γ-lyase in activity in the presence of L-methionine was approached from progress curve analysis"Anal.Biochem.. (in press). (2004)

[Publications] Hayashi F., Suzuki H., Iwase R., Uzumaki T., Miyake A., Shen JR., Imada K., et al.: "ATP-induced hexameric ring structure of the cyanobacterial circadian clock protein Kai C"Genes Cells. 8. 287-96 (2003)

稲垣賢二岡山大学, 農学部, 教授 (80184711)