プロテオリポソームとクロマフィン小胞との融合による人工神経内分泌小胞の創製

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14580676
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 鍔木 基成 神戸大学, 大学院・自然科学研究科, 教授 (00145046)
• Keywords: チトクロムb561 / アスコルビン酸 / 電子伝達反応 / ヘムタンパク質 / 膜タンパク質 / 神経内分泌小胞 / カテコールアミン / ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ

Research Abstract

生体内での神経伝達物質の合成・放出に携わる神経内分泌小胞には、cytochrome b_<561>(以下b_<561>)を中心とする膜貫通電子伝達系が存在し、細胞質のアスコルビン酸(AsA)から電子を受け取り、小胞内のモノデヒドロアスコルビン酸ラジカルを還元する。この結果、銅含有酸素添加酵素(DBH・PAM)へ電子を供与することが可能となり神経伝達物質の合成が行われる。ウシ副腎髄質より精製したb_<561>分子中には異なる中間点電位(+155mV, +62mV)を持つ2つのheme B(g_z=3.12、g_z=3.69)が小胞内腔側と細胞質側に存在している。我々は酸化型b_<561>をDiethyl pyrocarbonate (DEPC)により処理するとHis88、His161、Lys85の部位がN-carbethoxy化され、AsAからの電子受容が阻害されることを見い出している。
Extrusion法によりb_<561>が膜中に埋め込まれ、しかも内腔にAsAを封入した人工小胞を作った。小胞外に酸化還元系発色試薬MTTを添加したところ、試薬が還元されホルマザンが生成することを確認した。さらに小胞外に酸化型ヘムタンパク質cytochrome cを添加するとヘムは還元された。酸化型でDEPC処理したb_<561>を人工小胞中膜に埋め込み同様の実験をしたところ、電子伝達反応は顕著に阻害されることから、膜中のb_<561>が内腔AsAからの膜貫通電子伝達を触媒することが証明された。b_<561>を埋め込んだ人工小胞をtrypsin処理し、SDS-PAGEとMALDI-TOF-MSで解析した結果、主要な切断部位は神経内分泌小胞においては内腔側に面しているLys191であった。他のマイナーな切断部位も内腔側の部位であった。即ち人工小胞膜中ではb_<561>は本来の向きとは逆向きに入っていると思われる。AsAを封入した人工小胞の外側に精製した水溶性dopamine β-hydroxylase (DBH)を添加し、dopamineのアナログであるtyramineを酵素基質として加えると、その水酸化物であるoctopamineが生成することをHPLC解析により検出することができた。この活性は人工的な電子伝達mediatorであるferricyanideを添加すると顕著に増加した。AsAのみを封入した人工小胞の場合にはほとんど酵素活性は見られなかった。以上のことからAsA→b561→mediator→DBHという順方向の膜貫通電子伝達による再構成反応系を構築する事が可能となった。

Research Products

• [Publications] Asada, A.: "Planarian cytochrome b561 : Conservation of a six transmembrane structure and localization along the central and peripheral nervous system"J. Biochem.. 131. 175-182 (2002)
• [Publications] Nakamura, M.: "Cytochrome b561 is not fatty acylated but acetylated at the amino terminus in the chromaffin vesicle membranes : An approach for identification of the post-translational modification of transmembrane proteins"Protoplasma. (in press). (2003)
• [Publications] Tsubaki, M.: "Transmembrane electron transfer in the neuroendocrine vesicles : The ascorbate-cytochrome b561 system"Curr. Topics in Biochem. Res.. (in press). (2003)
• [Publications] Tsubaki, M.: "Cytochrome b561-catalyzed transmembrane electron transfer in the neuroendocrine vesicles"Rec. Res. Develop. Biochem.. (in press). (2003)