ゼブラフィッシュを活用した第2相異物代謝酵素誘導機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14580680
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 小林 麻己人 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (50254941)
• Keywords: 異物代謝 / ゼブラフィッシュ / 転写制御 / 変異体スクリーニング / 分子生物学

Research Abstract

第2相異物代謝酵素群は、親電子性物質や酸化ストレスの刺激により転写レベルで発現誘導される。本研究では、この制御に関与する未知因子の単離同定を目的に、ゼブラフィッシュを用いた突然変異体スクリーニングを試みた。突然変異はエチルニトロソ尿素により導入し、スクリーニングは3世代交配法を用いて行った。突然変異体の探索は、5日幼魚の段階で、親電子性物質ジエチルマレイン酸及び金製剤オーラノフィン処理時のGstp遺伝子の発現誘導をin situハイブリダイゼーション法により観察する方法を用いた。これまで、125のF2ファミリーを解析し、形態形成異常を示す突然変異系統を70単離した。第2相誘導が異常となる系統の候補もでてきており、現在確認中である。一方、スクリーニングの迅速化・簡便化を目指し、誘導剤に応答して発光するトランスジェニックフィッシュの系統化を計画した。Gstpプロモーターの転写制御機構を初期胚を用いたGFPレポーター法により解析したところ、転写因子Nrf2がその発現誘導を司ることがわかった。欠失及び点変異レポーター構築を解析した結果、Nrf2による活性化には転写開始点上流約50bpに存在する配列(PARE配列と命名)が必要十分であることが明らかとなった。ゲルシフト解析の結果、Nrf2はPARE配列に直接結合することが明らかとなった。初期胚をジエチルマレイン酸で処理したところ、Gstp-GFPレポーター遺伝子由来のGFP発光が誘導された。この構築をゲノムに安定してもつトランスジェニックフィッシュの系統化を目指した結果、3系統を得ることができた。

Research Products

• [Publications] Kobayashi, M.: "Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keap1 pathway of antioxidant gene regulation"Antioxid.Redox Signal.. (印刷中). (2004)
• [Publications] Kimura-Yoshida, C.: "Characterization of the pufferfish Otx2 cis-regulators reveals evolutionarily conserved genetic mechanisms for the vertebrate head specification"Development. 131(1). 57-71 (2004)
• [Publications] Nishikawa, K.: "Self-association of Gata1 enhances transcriptional activity in viva in zebra fish embryos"Mol.Cell.Biol.. 23(22). 8295-8305 (2003)
• [Publications] Kobayashi, M.: "Identification of the interactive interface and phylogenic conservation of the Nrf2-Keap1 system"Genes Cells. 7(8). 807-820 (2002)
• [Publications] Kobayashi, D.: "Early subdivisions in the neural plate define distinct competence for inductive signals"Development. 129(1). 83-93 (2002)
• [Publications] 小林麻己人: "親電子性物質センサー分子同定を目指したゼブラフィッシュの活用"実験医学. 20. 1656-1661 (2002)