神経結合形成時における細胞膜関連分子機能動態の生組織イメージングによる解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14580723
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 井上 明宏 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (80322080)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡部 繁男 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (60204012)
• Keywords: シナプス後肥厚部 / 組織培養系 / シナプス形成 / カドヘリン / GFP / アデノウイルスベクター / シンドビスウィルスベクター

Research Abstract

本研究の代表者、分担者らは、中枢神経細胞間でのシナプス後肥厚部(PSD)に特異的に存在して膜を裏打ちすることで知られるPSD95やPSD-Zip45などの分子と、緑色蛍光たんぱく質(GFP)やその変異体との融合たんぱく質を遺伝子工学的に作製し、げっ歯類胎児海馬由来神経細胞の分散培養系において、細胞が生きた状態でシナプスを可視化し、その動態を経時的に記録し、解析してきた。
1.上記の様な解析を、より生体内の現象に近い神経連絡を保った状態で観察するために、海馬スライスの回転培養系を確立し、アデノウィルスを用いてGFP遺伝子を発現させ、二光子励起蛍光顕微鏡を用いた観察により、神経細胞樹状突起中の棘突起における、蛍光分子が観察できるようになった。そこで、PSD95-GFP、Zip45-GFPを発現させた。ところ、ほぼ分散培養系と同様のシナプス部位への集積と、動態パターンをとることがわかった。
2.上記の一連の方法を用いて、シナプス形成、維持におけるN-カドヘリンの役割を調べる目的で、N-カドヘリンの翻訳を抑制するアンチセンスオリゴDNAを作製し、グリア細胞初代培養系での効果を確認した。現在、このシステムをスライス培養系にも適用すべく実験中である。
3.遺伝子発現のさらなる効率の上昇を目指し、シンドビスウイルスベクターを試したところ、海馬スライス中で、主に神経細胞において、感染後数時間以内にGFPの強い発現が見られた。
4.シンドビスウィルスベクターを用いて、新規に見いだされたNMDA受容体結合能をもつRhoフアミリーGTPaseの活性化タンパク質とGFPの融合タンパク質を海馬初代分散培養細胞に発現させ、そのPSDへの局在を確認した。

Research Products

• [Publications] Okabe S.: "Birth growth and elimination of a single synapse"Anatomical Science International. 77. 229-236 (2002)
• [Publications] Nakatomi H, Kuriu T, Okabe S, et al.: "Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors"Cell. 110・4. 429-441 (2002)
• [Publications] Usui S, Konno D, hori K, Maruoka H, Okabe S, Fujikado T, Tano Y, Sobue K: "Synaptic targeting of PSD-Zip45 (homer 1c) and its involvement in the synaptic accumulation of F-actin"Journal of Biological Chemistry. (in press). (2003)
• [Publications] Ebihara T, Tawabata I, Usui S, Sobue K, Okabe S: "Synchronized formation and remodeling of postsynaptic densities : long-term visualization of hippocampal neurons expressing postsynaptic density proteins"Journal of Neuroscience. (in press). (2003)