RNA干渉法を用いた哺乳動物における時期特異的ノックアウト法の開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14580798
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 高田 達之 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 助教授 (90206756)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 博 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (00110560)
• Keywords: RNA干渉法 / ノックアウト / ARL

Research Abstract

初期胚へ導入した遺伝子、DNA, RNAがどのくらい長く安定に存在するかという物理的安定性、およびそれらがどれくらいの間転写され続けるかという機能的安定性は正確にわかっていない。通常使用される1細胞期受精卵へのマイクロインジェクション法を使用した場合、その安定性は胚盤胞期胚までとされているが正確に検討されたものではない。そのためどのような方法を使用すれば効率よく初期胚にdsRNA, siRNAを導入することができ、またその効果がどれだけの期間持続するかを明らかにする必要がある。そこで初年度は卵子、前核期受精卵、胚盤胞期胚への遺伝子導入方法の検討を行った。そのためモデルシステムとして検出が容易な蛍光蛋白GFP遺伝子の導入を試みた。まず卵子への導入は精子に遺伝子を結合させるスパームベクター法を応用し、高価なマニピュレーターを使用せず、IVF法を改良しておこなった。その結果、IVF法でも卵子に遺伝子の導入が可能でほぼ100%の導入効率で受精卵がGFP蛍光を発していた。但し、この場合のGFP蛍光は弱く、また発生率が悪いという欠点が認められたためこれらの点を今後改善する必要がある。前核期受精卵への導入では胚盤胞期胚において初めて弱いGFP蛍光が観察された。胚盤胞期胚への導入を試みたところ、翌日弱いGFP蛍光が観察されることが分かった。今後、胚盤胞期胚を移植し着床させてその後の発現を調べると共に実際のdsRNA, siRNAを導入してその発現抑制効果を明らかにする予定である。

Research Products

• [Publications] Takada T, Suzuki Y, Kondo Y, Kadota N, Kobayashi K, Nito S, Kimura H, Tori R: "Monkey embryonic stem cell lines expressing green fluorescent protein"Cell Transplantation. 11・7. 631-635 (2002)
• [Publications] 高田達之, 成田純子, 鳥居隆三: "カニクイザル体細胞を用いたクローン胚作製"遺伝子医学-Gene and Medicine. 7・2. (2003)