デオキシ糖含有抗生物質の生合成における配糖化関連酵素遺伝子の機能解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14593002
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 市瀬 浩志 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (40282610)
• Keywords: デオキシ糖 / 抗生物質 / 生合成遺伝子 / 放線菌

Research Abstract

(研究目標)
放線菌Streptomyces fradiae由来angucycline系抗生物質Urdamycin A構成デオキシ糖であるD-olivose(D-oliv)とL-rhodinosc(L-rhod)の4っの糖転移酵素(GT)のうち、GT1b及びGT1cはL-rhod及びD-olivの転移を特異的に触媒する。両者の基質特異性決定の要因を探るため両者のキメラ体を構築・発現させ,そのGT活性を検討してきた。今回は両GTで差異が大きい領域に関してDNAシャフリングを施し、新規なGT活性を見出したので報告する。
(今年度の研究成果)
5領域(I, IIa, IIb, III, IV)に分割したGT1b及びGT1cのうち、領域IIは50残基中18箇所と最も大きな差異がみられたので、この18残基をシャフリングの対象とした。改変箇所を絞りこむため、領域IIで改めてサブキメラ体を構築し、両GT活性に影響を与えない残基を探索したところ、8箇所を改変対象から除外することができた。残り10箇所についてPCRを利用したDNAシャフリングを行い、改変型GTを構築した。これらをermEプロモーター下流に組み込んだ発現プラスミドとし、S.fradiaeのXTC mutant及びAx mutantを発現宿主に用い、各プラスミドを導入した。形質転換体を液体培養し,培地の酢酸エチル抽出物を逆相系HPLC及びLC/MSにて分析し、基質並びに配糖化産物を検出することにより活性を評価した。Ax mutant及びXTC mutantでの形質転換体をそれぞれ400及び198検体について検討したところ、天然型やこれまでのキメラにはみられなかったGT1bとGT1cの双方の活性を有するものの他、新規GT活性として分枝型糖鎖を有するurdamycin Pを与える改変型GTの創出に成功した。

Research Products

• [Publications] D.Hoffineister, B.Wilkinson, G.Foster, P.J.Sidebottom, K.Ichinose, A.Bechthold: "Engineered Urdamycin Glycosyltransferases Are Broadened and Altered in Substrate Specificity"Chemistry & Biology. 9. 287-295 (2002)