2002 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質相互作用解析のためのブロッティング測定法の超高感度化の試み
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14655311
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
加藤 滋雄 神戸大学, 自然科学研究科, 教授 (20026272)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝田 知尚 神戸大学, 自然科学研究科, 助手 (50335460)
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| Keywords | リポソーム免疫測定法 / ブロッテイング / PVDF膜 / 化学発光測定 |
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| Research Abstract |
細胞内で発現されている未知微量タンパク質の機能を解析するプロテオーム解析においては、タンパク質間相互作用を明らかにする必要がある。発現タンパク質は二次元電気泳動等で検出されるが、これらのタンパク質のうち特定タンパク質と相互作用をするものを見い出すためには、結合定数を考慮すれば発現タンパク質検出よりもはるかに高感度の検出法が必要となる。従来の電気泳動後の銀染色等による検出感度はスポット当たり数百pgであり、標識抗体を用いるいわゆるウエスタンブロットの感度は、通常の発色法で百pg、化学発光などによっても、数十pgである。この検出感度を高めpgオーダーの検出感度を有するブロッティング測定法を提案すれば、特定タンパク質と比較的弱い親和力を含め相互作用するタンパク質を同定することができるようになる。そこで、高感度化の可能なリポソーム免疫測定法をメンブレンブロッティングに適用することを試みた。
このため、リポソームを破壊せずにシグナルを検出できるようにリポソーム膜透過性のシグナル検出試薬を用いるか、膜の特性を制御してシグナル検出試薬を透過させると共に、シグナルをリポソーム内に沈澱蓄積させるか、リポソーム内のみで化学発光検出されるようにし、シグナルの拡散を防ぎ、ブロッティング位置で明確なシグナルを得る方法について研究を行った。その結果 * 発色時リポソーム膜内で沈殿を形成するシステムを用い、PVDF膜へのブロッティングによって、20pgのタンパク質を検出することが出来た。
*化学発光システムの利用によってさらに高感度化がはかれ、数pgのタンパク質検出が可能となった。
今後さらなる高感度化と、マイクロブロッティングへの応用を検討する。
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