プロモーター配列のメチル化によるサイレンシングを利用した遺伝子ノックアウト育種法

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14656002
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 金澤 章 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (30281794)
• Keywords: メチル化 / ジーンサイレンシング / PTGS / TGS / siRNA / 遺伝子ノックアウト / プロモーター / ペチュニア

Research Abstract

遺伝子の機能解析を行うための方法ならびに植物における分子育種を推進する上で、ノックアウト系統の作出法の開発は重要な課題である。安定な遺伝子ノックアウトを得る方法として、プロモーター配列のメチル化を誘導し、それによる遺伝子特異的な転写不活性化を行うことがあげられる。本研究においては、植物細胞における遺伝子のプロモーター配列のメチル化の分子機構を解明すること、ならびにその原理に基づいて分子育種に利用可能な遺伝子のノックアウト系統を作成する方法を確立することを目的として研究を行った。プロモーターがメチル化されることによって遺伝子発現が変化する現象の分子機構を解析する系として、ペチュニアにおいてCaMV35Sプロモーター制御下で発現するカルコーン合成酵素遺伝子(CHS-A)を導入したペチュニア系統を用いた。この遺伝子の過剰発現によって、本来紫色に着色する花弁においてサイレンシング(コサプレッション)が誘導されることで白色の花弁をつけるようになった系統、および、それに由来する紫色の花をつける復帰系統の比較を行った。その結果、トランスジーンが転写不活性化されている復帰系統において、トランスジーンのプロモーター配列のas-1配列を含む転写開始点の近傍の領域におけるメチル化の状態が、転写活性のある系統より高いことを見出した。また、CaMV35Sプロモーター配列に対する転写因子の結合が、プロモーター配列のメチル化によってin vitroで阻害されることを明らかにした。さらに、二本鎖RNAを介したトランスジーンのプロモーター配列のトランスなメチル化系の開発を行った。

Research Products

• [Publications] Kazunori Goto: "A simple and rapid method to detect plant siRNAs using nonradioactive probes"Plant Molecular Biology Reporter. 21. 51-58 (2003)
• [Publications] Miwa Sakai: "Phylogenetic relationships of the chloroplast genomes in the genus Glycine inferred from four intergenic spacer sequences"Plant Systematics and Evolution. 239. 29-54 (2003)
• [Publications] Jun Abe: "Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSRs"Theoretical and Applied Genetics. 106. 445-453 (2003)
• [Publications] Jun Abe: "Photoperiod-insensitive Japanese soybean landraces differ at two maturity loci"Crop Science. 43. 1300-1304 (2003)
• [Publications] 島本 義也: "農学生命科学(バイオテクノロジー)祖田 修・松田藤四郎編「戦後日本の食料・農業・農村 第10巻 農業および農業教育、普及」"農林統計協会. 552 (2003)