ヘム蛋白プロファイリングによる細胞膜酸素センサー分子の同定

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14657032
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 山本 博 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (00115198)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡邉 琢夫 金沢大学, 医学系研究科, 助教授 (40303268)
• Keywords: 酸素センサー / ヘム蛋白 / 蛋白プロファイリング / oxygen sensor / heme proteins / protein profiling

Research Abstract

本研究の目的は、細胞膜上にヘム蛋白性酸素感受性イオンチャンネルを持つPC12細胞を用い、その細胞膜画分のヘム蛋白をプロファイリングすることにより、新規酸素感受性分子(酸素センサー)を同定することである。
平成14年度の研究は当初計画通りに遂行され、以下の成果を得た。
1.本研究で同定を目指している蛋白は膜蛋白であり、通常の2次元電気泳動法では分離が困難であると考えられた。このため、使用する蛋白変性剤・界面活性剤、および泳動条件の最適化を行なった。この結果、PC12細胞の全膜画分の膜蛋白を、最適化した2次元電気泳動法により十分な分離能をもって展開することに成功した。
2.ヘム分子団のペルオキシダーゼ様活性に基づきヘム蛋白を特異的に検出する、ルミノール化学発光反応を応用したヘム蛋白検出法を確立した。
(1)PC12細胞の全膜画分および細胞膜画分の蛋白を1次元電気泳動法により分離した。この際、ヘム分子団のポリペプチドからの脱落を最小限に抑えるため、Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)の代わりにLithium Dodecyl Sulfate (LDS)を用いたポリアクリルアミドゲルを作製し、低温下での電気泳動を試み、その至適条件の検討を行なった。
(2)泳動後、ゲルをルミノールと過酸化水素を含む溶液中でインキュベートし、フルオログラフィーによるヘム蛋白検出を試み、その至適条件の検討を行なった。
(3)以上の結果、PC12細胞の全膜画分および細胞膜画分それぞれにおいて、ヘム蛋白と思われる数本のバンドを検出することに成功した。それぞれの画分において検出されたヘム蛋白群の分子量は明らかに異なっており、局在するヘム蛋白の種類の違いを反映しているものと思われた。

Research Products

• [Publications] Petrova, G.R.: "Advanced glycation endproduct-induced calcium handling impairment in mouse cardiac myocytes"J. Mol. Cell. Cardiol.. 34・10. 1425-1431 (2002)
• [Publications] Yamagishi, S.: "Advanced glycation end products-induced apoptosis and overexpression of vascular endothelial growth factor in bovine retinal pericytes"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 290・3. 973-982 (2002)
• [Publications] Yonekura, H.: "RAGE engagement and vascular cell derangement by short chain sugar-derived advanced glycation endproducts"The Maillard Reaction in Food Chemistry and Medical Science : Update for The Postgenomic Era. 1245. 129-135 (2002)
• [Publications] Yamamoto, Y.: "The role of AGE-RAGE system in the development of diabetic nephropathy in vivo"The Maillard Reaction in Food Chemistry and Medical Science : Update for The Postgenomic Era. 1245. 45-50 (2002)
• [Publications] Sakurai, S.: "Identification of a novel AGE-capturable soluble variant of the receptor for AGE in human sera"The Maillard Reaction in Food Chemistry and Medical Science : Update for The Postgenomic Era. 1245. 163-167 (2002)
• [Publications] Yonekura, H.: "Novel splice variants of the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) expressed in human vascular endothelial cells and pericytes, and their putative roles in diabetes-induced vascular injury"Biochem. J.. 370・3. 1097-1109 (2003)
• [Publications] Miura, J.: "Serum levels of non-carboxymethyllysine advanced glycation endproducts and correlated to severity of microvascular complications in patients with Type 1 diabetes"J Diabetes Complications. 17・1. 16-21 (2003)
• [Publications] Miura, J.: "AGE downregulation of monocyte expression of RAGE mRNA and its association with diabetic complications in type 1 diabetes"J Diabetes Complications. (in press). (2003)
• [Publications] Unoki, H.: "Cyr61 upregulation in vascular smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats"Lab. Invest.. (in press). (2003)
• [Publications] Kim, Y.M.: "PNUTS, a protein phosphatase 1 (PP1) nuclear targeting subunit : Characterization of itsPP1-and RNA-binding domains and regulation by phosphorylation"J. Biol. Chem.. (in press). (2003)
• [Publications] 山本 靖彦: "Development and prevention of advanced diabetic nephropathy in RAGE-overexpressing mice"ゲノムニュース(文部科学省 科学研究費特定領域研究C「ゲノム」4領域広報委員会). 1(1). 32-33 (2002)
• [Publications] 山本 靖彦: "AGE-RAGE系を標的とした糖尿病血管障害抑制の可能性"日本薬理学会誌. 121(1). 49-56 (2003)
• [Publications] 山本 靖彦: "糖尿病学2002"診断と治療社. 4 (2002)
• [Publications] 大沢 真里: "Annual Review 2003 腎臓"中外医学社. 5 (2003)
• [Publications] 山田 外史: "生体と電磁界"学会出版センター. 25 (2003)
• [Publications] 山本 博: "医学のための基礎分子細胞生物学(第3版)"南山堂(in press). (2003)