ヘム蛋白プロファイリングによる細胞膜酸素センサー分子の同定

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14657032
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 山本 博 金沢大学, 医学系研究科, 教授 (00115198)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡邉 琢夫 金沢大学, 医学系研究科, 助教授 (40303268)
• Keywords: 酸素センサー / ヘム蛋白 / 蛋白プロファイリング / oxygen senser / heme proteins / protein profiling

Research Abstract

本研究の目的は、細胞膜上にヘム蛋白性酸素感受性イオンチャンネルを持つPC12細胞を用い、その細胞膜画分のヘム蛋白をプロファイリングすることにより、新規酸素感受性分子(酸素センサー)を同定することである。
平成14年度中の研究により、Lithium Dodecyl Sulfate (LDS)を用いた低温下ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(LDS-PAGE)と、ヘム分子団のペルオキシダーゼ様活性に基づきヘム蛋白を特異的に検出するルミノール化学発光反応を組み合わせた、高感度ヘム蛋白検出法を確立した。
平成15年度の研究は当初計画通りに遂行され、以下の成果を得た。
1.PC12細胞の粗精製細胞膜画分蛋白を低温下LDS-PAGEにより分離後、ルミノール化学発光反応液中でインキュベートしフルオログラフィーをとることにより、粗精製細胞膜画分に含まれるヘム蛋白のバンドを同定した。さらに、同一試料を並行して泳動したレーンをクマジーブリリアントブルーで染色することによって得られた全蛋白の染色バンドと、フルオログラム上のヘム蛋白のバンドの位置を比較することにより、ヘム蛋白を含むと推定される蛋白のバンドを同定した。
2.1.によって同定された蛋白のバンドを切り出し、そこに含まれる蛋白を、液体クロマトグラフィー・マススペクトロメトリー法によって同定した。その結果、約50種の蛋白が同定された。
3.現在、2.によって同定された蛋白の中から、構造や推定される機能などに基づいてヘム蛋白である可能性の高いものを抽出し、ヘムとの結合性を検討中である。すでに、ソーレーバンド(蛋白とヘムとの結合により見られる波長400nm付近の特異的吸収帯)などにより、ヘムとの安定した結合が確認されている蛋白もある。今後、これらの新規ヘム蛋白の機能の解析を進めていく予定である。

Research Products

• [Publications] Yonekura, H.: "Novel splice variants of the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) expressed in human vascular endothelial cells and pericytes, and their putative roles in diabetes-induced vascular injury."Biochem.J.. 370(3). 1097-1109 (2003)
• [Publications] Watanabe, T.: "Preparation and characterization of recombinant protein phosphatase 1."Methods Enzymol.. 366. 321-338 (2003)
• [Publications] Young-Mi Kim: "PNUTS, a protein phosphatase 1 (PP1) nuclear targeting subunit."J.Biol.Chem.. 278(16). 13819-13828 (2003)
• [Publications] Miura, J.: "Serum levels of non-carboxymethyllysine advanced glycation endproducts are correlated to severity of microvascular complications in patients with Type 1 diabetes."J Diabetes Complications. 17(1). 16-21 (2003)
• [Publications] Sakurai, S.: "The AGE-RAGE system and diabetic nephropathy."J.Am.Soc.Nephrol.. 14(suppl.3). S259-S263 (2003)
• [Publications] Unoki, H.: "Up-regulation of cyr61 in vascular smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats."Lab. Invest. 83(7). 973-982 (2003)
• [Publications] Yonemura, Y.: "REG gene expression is associated with the infiltrating growth of gastric carcinoma."Cancer. 98(7). 1394-1400 (2003)
• [Publications] Miura, J.: "AGE down-regulation of monocyte RAGE expression and its association with diabetic complications in type 1 diabetes."J Diabetes Complications. 18(1). 53-59 (2004)
• [Publications] Ohashi, S.: "Advanced glycation end products increase collagen-specific chaperone protein in mouse diabetic nephropathy."J.Biol.Chem.. (In press). (2004)
• [Publications] Li, H.: "Possible participation of plCln in the regulation of angiogenesis through alternative splicing of VEGF receptor mRNAs."Endothelium. (In press). (2004)
• [Publications] Yamamoto, Y.: "Nurture vs. nature in diabetic vasculopathy : roles of advanced glycation endproducts and the receptor for them."International Congress Series. (In press). (2004)
• [Publications] 山本 博: "高血糖による酸化ストレスと血管障害機構"Medical Tribune. 36(49). 18-19 (2003)
• [Publications] 山本 靖彦: "AGE-RAGE"内科. 91(6). 1419-1420 (2003)
• [Publications] 渡邉琢夫: "糖尿病血管症の分子機構"生化学. 75(10). 1361-1370 (2003)
• [Publications] 竹内正義: "高血糖とAGE:新しい治療戦略"Bio Clinica. 18(7). 47-51 (2003)
• [Publications] 李 慧: "血管新生系制御"血管医学. 4(2). 41-46 (2003)
• [Publications] 徐 成金: "糖尿病血管合併症の環境因子と遺伝子"Diabetes Journal. 31(1). 1-6 (2003)
• [Publications] 山本 博: "医学のための基礎分子細胞生物学(pp2-3,pp34-39,pp86-87,pp90-91)"南山堂. 12 (2003)
• [Publications] 渡邉琢夫: "医学のための基礎分子細胞生物学(pp92-93,pp102-103)"南山堂. 4 (2003)
• [Publications] 山本 博: "医学大辞典(p84,p92,p809,p1111,p1213)"医学書院. 5 (2003)
• [Publications] 山本 博: "生体と電磁界(pp.51-75)"学会出版センター. 25 (2003)