特殊ベント・プロモーターを利用した新規高発現ベクターの構築

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14657069
• Research Institution: Kagawa University
• Principal Investigator: 岡部 昭延 香川大学, 医学部, 教授 (20093677)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 玉井 栄治 香川大学, 医学部, 助手 (40333512) ; 宮田 茂 香川大学, 医学部, 助手 (90314913) ; 松下 治 香川大学, 医学部, 助教授 (00209537)
• Keywords: Clostridium perfringerns / ウエルシュ菌 / クロストリジウム / 発現ベクター / フェレドキシン / ベントDNA / シアリダーゼ / コラゲナーゼ

Research Abstract

ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)のフェレドキシン遺伝子のプロモーターの上流域からプロモーター内部にかけて存在する5つの連続するPhased A-tractsは、新しいタイプのBent DNAであり、その折れ曲がり角度は110°と強い。上流3つのA-tractsと下流2つのA-tractsの相乗作用によりフェレドキシンのプロモーターを活性化することを明らかにした。この特殊なベント・プロモーターをC.perfringens/Escherichia coliのシャトル・ベクター兼プロモーター選択ベクターであるpPSVにクローン化し、高発現ベクターpFFを構築した。C.perfringens/pFF系の有用性を調べるために、C.perfringensの75kDaのシアリダーゼ(NanI)の構造遺伝子とpFFをTranscriptional fusionし、pFFNを構築した。対照として、nanI遺伝子の全領域を組み込んだベクターpPSVNを構築した。さらにAT-rich遺伝子の高発現系として開発されたE.coli BL21(DE3)CodonPlus-RILにおけるNanI産生能と比較するために、pUC19にnanIをクローン化した。C.perfringes/pFFNは、C.perfringens/pPSVNの60倍、大腸菌系の約15倍の産生を示した。培養液100mlから2段階精製法で約3mgの高純度のNanIが精製された。以上のことから、C.perfringens/pFF系はシアリダーゼの高発現系に有用であることが明らかとなった。pFFの有用性について、120kDaのコラゲナーゼ遺伝子についても同様に検討したところ、発現量の改善は見られたが、C.perfringens菌そのものを培養した時と同様に、分解産物も認められた。コラゲナーゼ産生のためには、今後Protease欠損の変異株の利用や培養条件などについて検討する必要があることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Masato Kaji: "A novel type of DNA curvature present in a Clostridium perfringens ferredoxin gene : characterization and role in gene expression."Microbiology. 149・11. 3083-3091 (2003)
• [Publications] Akihisa Takamizawa: "High-level expression of clostridiial sialidase using a ferredoxin gene promoter-based plasmid."Protein Expression and Purification. in press. (2004)