Gタンパク質共役型受容体ヘテロ複合体形成の解析と複合体作用薬開発への応用

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14657595
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 神谷 敏夫 財団法人東京都医学研究機構, 東京都神経科学総合研究所, 研究員 (80344068)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中田 裕康 財団法人東京都医学研究機構, 東京都神経科学総合研究所, 副参事研究員 (00041830) ; 齊藤 修 財団法人東京都医学研究機構, 東京都神経科学総合研究所, 研究員 (60241262)
• Keywords: アデノシン受容体 / A_<2A>R / ドーパミン受容体 / D_2R / ヘテロ複合体 / 線条体 / 免疫沈降法 / BRET

Research Abstract

ドーパミン神経伝達におけるアデノシン受容体A2サブタイプ(A_<2A>R)-ドーパミン受容体D2サブタイプ(D_2R)ヘテロ複合体の役割、分子機構を解明するために、両受容体間の直接的な相互作用を明らかにした。
1.線条体における両受容体ヘテロ複合体形成の検討 天然組織におけるヘテロ複合体形成を同定するために、ラット脳スライス切片を二重免疫染色して共焦点レーザー顕微鏡で観察し、また脳組織から膜画分を調製して免疫沈降を試みた。前者については、用いた抗体の特異性が低いことが明らかになった。
2.膜画分からの受容体の可溶化と免疫沈降法または単離の検討 A_<2A>RとD_2Rの安定高発現株を樹立した,この受容体あるいは一過性に発現させた受容体の生化学的性質を解析した結果、受容体は機能を維持した状態で細胞膜に、しかもそのアミノ末端を細胞膜外側にして発現しているが、抗タグ抗体による単一受容体の免疫沈降の効率が悪く、タグを複数個有する発現ベクターを新たに構築した。この受容体の生化学的性質を解析するとともに、免疫沈降法を試みて、A_<2A>RとD_2Rとが直接結合してヘテロ複合体を形成することを証明した。さらに両受容体の直接的な相互作用の解析を進めるために、両受容体の恒常的なヘテロ複合体モデルとなる、A_<2A>RとD_2Rとからなる融合受容体蛋白の作製を試みた。またさらに、ヘテロ複合体の単離を抗体アフィニティーカラムを用いて試みた。
3.BRETによる両受容体間相互作用の解析 A_<2A>RやD_2Rと、ウミシイタケ酵素ルシフェラーゼや蛍光タンパク質GFP^2との融合タンパク質を一過性に発現したトランスフェクタントを、アナライザーで計測することによって両受容体の直接的会合を分子レベルで、かつ細胞を破壊することなく生細胞の状態で解明した結果、A_<2A>RはD_2Rとヘテロ複合体を形成するだけでなく、ホモ複合体を形成することを明らかにした。