蛍光マイクロビーズアレイを用いたレクチン糖結合特異性の網羅的解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14658191
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 山本 一夫 東京大学, 大学院・新領域創成科学研究科, 教授 (20174782)
• Keywords: レクチン / 糖結合特異性 / 蛍光分析 / マイクロビーズアレイ

Research Abstract

ポストゲノム研究の一つに多数の糖鎖の生物学的活性を網羅的に評価する系の確立が緊急性・重要性の高い今後の課題として取り上げられている。本研究はサスペンジョンのままアレイテクノロジーを応用できる蛍光マイクロビーズアレイを用い、レクチンと糖鎖との結合を解析する実験系の確立を目指した。Luminex社から販売されている蛍光マイクロビーズアレイを用い、このビーズ表面に存在するカルボキシル基に精製した糖鎖(糖ペプチド)をEDCによってカップリングした。カップリングに用いるための糖ペプチドの調製は、ブタチログロブリン、ニワトリ卵白アルブミン、ウシフェツイン、ウシ顎下腺ムチン等からプロナーゼ消化、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を用いて行った。精製標品の確認は、MALDI-TOF MSを用い、その分子量を基づき行った。糖ペプチドをカップリングした蛍光ビーズを16種類ほぼ等量ずつ混合したのち、これらの浮遊液に16種類のビオチン化レクチン溶液を加え反応させた。さらにFITC標識したアビジンを加え、サイトフローメトリーで16種類のビーズに結合するFITCの強度を測定した。測定に際して未反応のFITCビオチンやレクチンを除去しなくても、再現性のある定量的な結果が得られた。またその結果から導かれる親和性の大小は、既に他の方法で明らかにされた結果と良く一致しており、微量かつ迅速に測定できる点で本手法は優れていた。今後、種類を増やすこと、オリゴ糖、糖アルコールの固定化法の確立を目指し、より汎用性の高い実験系の構築を試みる。

Research Products

• [Publications] Sakamoto H.: "Modulation of heat-shock protein 27 (Hsp27) anti-apoptotic activity by methylglyoxal modification"J.Biol.Chem.. 277. 45770-45775 (2002)
• [Publications] Sun Y.: "Characterization and expression of L-amino acid oxidase of mouse milk"J.Biol.Chem.. 277. 19080-19086 (2002)
• [Publications] Higashi N.: "The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalac tosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells"J.Biol.Chem.. 277. 20686-20693 (2002)
• [Publications] K.Yamamoto: "Protein Protocols Handbook, 2nd Edition"Affinity chromatography of oligosaccharides and glycopeptides with immobilized lectins. 917-931 (2002)