2002 Fiscal Year Annual Research Report
新規非膜系オルガネラcentriolar satellitesの構造・機能解析
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14770047
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
久保 亮治 京都大学, 医学研究科, 助手 (70335256)
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| Keywords | PCM-1 / 中心体 / 微小管 / Centriolar satellites / 細胞生物学 |
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| Research Abstract |
1.PCM-1のドミナントネガティブ変異体によるcentriolar satellitesの機能・構造解析
あるPCM-1蛋白の変異体を細胞で発現させると、細胞内で大きなself aggregateを形成し、そのaggregateにはendogenousなPCM-1蛋白が取り込まれる。このself aggregation活性を持つ部位を詳細に検討した結果、PCM-1蛋白には、self aggregate活性を持つ2つの独立した部位が存在することがわかった。また、Yeast two hybrid assayにより、その2つの部位はそれぞれが自分同士で直接に結合する事がわかった。この変異体を発現させた細胞をライブで観察したところ、mutant PCM-1によって生じたself aggregateが、分裂期には急速に崩壊・縮小して細胞質に散らばり、分裂終期に再構成されて元の大きさまで戻る様子が観察された。以上の結果より、PCM-1蛋白はcentriolar satellitesのscaffold proteinであり、PCM-1蛋白同士の結合が分裂期に消失する(例えば分裂期特異的に働く蛋白リン酸化酵素によりPCM-1蛋白がリン酸化されself aggregation活性を失う)事で、分裂期にcentriolar satellitesがdisassembleされる事がわかった。
また、この変異体を発現させた細胞では、間期において中心体に集積するガンマチュブリンの量が減少し、中心体の微小管nucleating activityが減少していることがわかった。つまりPCM-1を含むcentriolar satellitesが、中心体周辺物質の中心体への移送、構築のmachinaryに深く関わっている可能性が示唆された。
2.PCM-1遺伝子の細胞レベルでのノックアウト
テトラサイクリン依存性にPCM-1蛋白が安定して発現するES細胞を樹立した。またPCM-1遺伝子のターゲッティングベクターを作成した。また、RNAiによりPCM-1の発現量が大きく減少するsiRNAを同定した
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Research Products
(2 results)
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[Publications] Akiharu Kubo, H.Sasaki, A.YubaKubo, S.Tsukita, N.Shiina: "Centriolar satellites : molecular characterization, ATP-dependent movement toward centrioles and possible involvement in ciliogenesis"Journal of Cell Biology. 147巻、5号. 969-980 (1999)
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[Publications] Akiharu Kubo, Shoichiro Tsukita: "Non-membranous granular organelle consisting of PCM-1 : subcellular distribution and cell-cycle-dependent assembly/disassembly"Journal of Cell Science. 116巻、5号. 919-928 (2003)
