KRAZ及びKAP-1のヘテロクロマチン領域における転写抑制メカニズムの解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14770052
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 松田 永照 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (00335481)
• Keywords: KRAB / KRAZ / KAP-1 / セントロメリックヘテロクロマチン / tet / HP1 / Chromatin immunoprecipitation / メチル化

Research Abstract

申請者が単離したKRAB Znフィンガー蛋白であるKRAZがKAP-1(KRAB Associated Protein-1)というco-repressorを介してセントロメリックヘテロクロマチンに局在し、この局在能力と転写抑制活性との相関を報告したが、詳細な分子機構は不明な点が多い。KRAZ/KAP1のヘテロクロマチン複合体形成の分子機構を明らかにすることを目的で、tet inducible transactivatorをstable lineに導入し、細胞株を樹立した。さらにこの細胞株から、GAL4(DNA結合領域)-KRAZ1融合蛋白と、VP16とKAP-1各欠失変異体との融合蛋白をtetによるon/off可能な発現vectorに組み込み、それぞれのstable lineを得た。Reporter assay法及び共焦点顕微鏡を用いた免疫蛍光染色法の結果、(1)、KRAZ/KAP-1のセントロメリツクヘテロクロマチンにへの局在がHP1(Heterochromatin Protein1)に依存すること。(2)、KRAZ1-KAP-1融合蛋白による転写抑制が、対象遺伝子領域の転写抑制核内コンパートメントへの移動によること。(3)この局在能力と転写抑制活性が相関することをstable lineにおいても確認した。
KRAZ/KAP1のヘテロクロマチン複合体形成におけるヒストン修飾の役割を明らかにするため、抗ヒストンH3、抗ヒストンH4の抗体を用いたChromatin immunoprecipitation (Chip) assay法、reporter assay法を行った。その結果、KRAZ/KAP1の複合体の形成及び転写抑制にはメチル化されたリジン(H3-K9)、アセルチ化されたリジン(H3-K14)が関与することが分かった。