正常および異常腎発生におけるRhoAおよびRhoAキナーゼの意義

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14770576
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 飛彈 麻里子 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (20276306)
• Keywords: 腎の発生 / small GTPase / RhoA / ROCK / 接着因子 / nephrogenesis / tubulogenesis / ラット

Research Abstract

本研究の目的は、低分子G蛋白RhoファミリーGTPaseの一員RhoAの腎発生における意義を検討することである。平成14年度は、胎児ラット、新生児ラット、成熟ラットの腎臓におけるRhoAやRhoキナーゼROCKの発現を検討し、さらにROCKの阻害薬(Y27632 100μM)を用いて、ROCK阻害が腎発生に与える影響を検討した。その結果、RhoA、ROCKがともに胎児腎に発現し、成熟腎には発現を認めないこと、ROCK阻害により尿細管の変形、糸球体形成の障害、腎サイズの増大を認めた。平成15年度はY27632をより低濃度で用いて実験を行い、14年度と同傾向の結果を得た。さらに組織学的検討でROCK阻害は、細胞増殖やアポトーシスには影響を与えずに(PCNA免疫組織染色やTUNEL法の結果から)、腎間葉細胞の分化を抑制(間葉細胞分化の指標であるWT-1蛋白発現の減少から)することを確認した。また、糸球体形成の障害が尿細管形成障害を介すか間葉細胞への直接作用によるものかを検討するために、脊髄も培養液に添加したが、糸球体形成の程度に変化はなく、ROCK阻害が間葉細胞に直接的な影響を与えていることを確認した。
平成16年度はROCK阻害の影響が可逆的なものか非可逆的なものかを検討した。Y27632を器官培養の培養液に添加し、18-24時間培養後にY27632無しの培養液に変更し更に計96時間まで培養を続けた(Rescue群)。Rescue群の腎臓は、尿細管の形態も糸球体形成数もY27632添加培養液のみで培養したものに比し有意に改善し、さらにその改善度はY27632存在下での培養時間と負の相関を示した。さらにROCK阻害が腎発生に与える影響の機序を考察するために、ROCKの下流にある細胞骨格や細胞接着因子に変化が起きているという仮説を建て、免疫組織染色やウエスタンブロットを用いて、laminin、actin、phospho-vimentinなどの発現を検討中である。予備実験の段階であるが、これらの因子の発現の抑制を認めている。
以上の結果を第17回国際腎臓学会議(Berlin,2003)で発表した。また発達腎研究会誌に投稿した(2003)。