プロテオーム解析を用いた、新たな内耳感染防御機構の解明

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14770931
• Research Institution: Nippon Medical School
• Principal Investigator: 長谷川 純 日本医科大学, 医学部, 助手 (80339415)
• Keywords: 外リンパ / 内耳 / 感染防御機構

Research Abstract

PLP16K蛋白を中心とした、2次元電気泳動による外リンパの解析を行っている。
我々は、COCH遺伝子産物Cochlin蛋白のLCCLモチーフ配列に対する抗体を用いた(1次元)ウェスタンブロッティングにより、外リンパ中に新規タンパクPLP16K蛋白を検出した。PLP16K蛋白の前駆産物であるCochlin蛋白は分子量、等電点が異なる全部で16個のアイソフォームから構成されていた。従ってPLP16K蛋白も燐酸化、糖鎖の付加などの様々な翻訳後修飾を受けている可能性がある。
そこで、先ずこの蛋白の発現を2次元電気泳動により解析する実験を行った。ウシ外リンパを採取し、蛋白を20倍体積のホモジェネート液で抽出した。2次元電気泳動には固定化pH勾配ゲルストリップ(Immobiline pH3-10)を用いた。1次元目に尿素変性条件下で等電点泳動をMultiphorII(Amersham Pharmacia Biotech)で行い、2次元目にSDS変性下で平板ゲル(3% stacking and 12% separating polyacrylamide gel)電気泳動を行った。電気泳動ゲルを銀染色、もしくはクマシーブルーで染色した。この結果、外リンパ特異的な泳動パターンが得られ,内耳蛋白の泳動パターンとは全く異なっていた。さらに抗LCCLモチーフ抗体でウェスタンブロッティングを行ったところ、陽性スポットは検出されなかった。今後、泳動条件を変更、泳動蛋白量を増やす、陽性スポットの検出方法を変更、などの条件設定をすることで、PLP16K蛋白を検出したい。将来的には、そのアミノ酸配列を解読し、PLP16K蛋白の蛋白レベルでの特徴を明らかにする。できれば全アミノ酸配列を同定し、前駆産物であるCochlin蛋白との関連性を明らかにする。