2002 Fiscal Year Annual Research Report
rhBMP-2誘導骨形成過程における内因性BMP-2の発現と骨誘導への関与
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14771129
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
中川 俊幸 三重大学, 医学部附属病院, 助手 (30242952)
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| Keywords | BMP-2 / Cbfal / 異所性骨形成 / RT-PCR |
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| Research Abstract |
rhBMP-2(5μg)とアテロペプチドI型コラーゲン溶液(6mg)を混合後,凍結乾燥を行い4×1.5mmのディスク状ペレットに圧縮成型した.6週齢雄性Wistar系rat10匹をペントバルビタール腹腔内投与にて麻酔後,左側下腿屈側皮膚を2cm切開し筋肉内にBMPペレットを移植した.移植後21日目に軟X線撮影により石灰化を確認後,BMPペレットを摘出し液体窒素で凍結した.-80℃で保存後,密閉型バイオミキサーとRNeasy Mini Kit^<【○!R】>を用いて摘出試料をホモジナイズしtotal RNAを抽出した.試料中のBMP-2 mRNAの存在を確認するためNorthern blottingに先立ってRT-PCRを行った.Omuniscript RT Kit^<【○!R】>を用いて逆転写酵素によりtotal RNAからcDNAを合成し,rat BMP-2 cDNA sequenceから作製したプライマーとHotStarTag DNA Polymerase^<【○!R】>を加え95℃15分加熱後,熱変性94℃1分,アニーリング55℃1分,伸長反応72℃1分でPCR反応を35サイクル行った.PCR産物の2%アガロースゲル電気泳動によりBMP-2 mRNAのバンドを確認した.次にrat BMP-2 cDNAから570bpの部分に対してプライマーを設定し,PCR DIG Probe Synthesis Kit^<【○!R】>を用いてRT-PCRによりジゴキシゲニン標識一本鎖cDNAプローブを作製し,Northern blotting及びin situ hybridizationを行う予定である.Cbfa1 mRNAについても同様の方法で実験を行う.
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