転写伸長を制御する因子の立体構造及びRNAポリメラーゼとの相互作用の解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14780528
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 杤尾 豪人 横浜市立大学, 大学院・総合理学研究科, 助手 (70336593)
• Keywords: RNAポリメラーゼ / 転写伸張

Research Abstract

HDAg(Hepatitis Delta Antigen)は全長195アミノ酸残基であるが、分析超遠心法によると見かけの分子量が六量体(140kDa)相当となっている。HDAgの会合はN末端のロイシンジッパーモチーフによって引き起こされると考えられること、HDAgのRNAポリメラーゼ結合能はC末端側の約70残基のみで再現されることが示されていることから、ロイシンジッパーを除いたHDAgのRNAポリメラーゼ結合領域(66残基、以下HDAg-Δ129と呼ぶ)のみのコンストラクトを研究に使用している。
HDAg-Δ129のN末端GST融合蛋白質として発現させようとしているが、大腸菌破砕後、融合蛋白質の大部分は封入体となって不溶画分となり、可溶画分に得られたものは全体の一割程度である。そこで、HDAg-Δ129の可溶化・巻き戻しを試みた。グアニジン塩酸塩や尿素で不要画分を可溶化、洗浄後、様々なバッファー条件に急速希釈した。しかしながら、未だ良好な可溶化条件が見つかっておらず、NMR測定に供するには十分な量の試料を調製できていない。
大腸菌を低温で培養することにより、封入体への経路を押さえることができるが、HDAg-Δ129では大きな効果は得られなかった。
そこで、現在は使用するベクターや、コンストラクトを変えて、高収率に蛋白質が発現・精製できる条件を探索している。

Research Products

• [Publications] Auesukaree C, Homma T, Tochio H, Shirakawa M, Kaneko Y, Harashima S.: "Intracellular phosphate serves as a signal for the regulation of the PHO pathway in Saccharomyces cerevisiae."Journal of Biological Chemistry. 279,17. 17289-17294 (2004)
• [Publications] Fujiwara K, Tenno T, Sugasawa K, Jee JG, Ohki I, Kojima C, Tochio H, Hiroaki H, Hanaoka F, Shirakawa M.: "Structure of the ubiquitin-interacting motif of S5a bound to the ubiquitin-like domain of HR23B."Journal of Biological Chemistry. 279,6. 4760-4767 (2004)