畑土壌における一酸化二窒素ガス消去微生物の特定・分離と発生削減技術への応用

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14F04390
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 妹尾 啓史 東京大学, 農学生命科学研究科, 教授 (40206652)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): SHEN Weishou 東京大学, 農学生命科学研究科, 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: 土壌学 / 畑土壌 / 一酸化二窒素ガス / 土壌微生物

Outline of Annual Research Achievements

新潟県農業総合研究所内の畑圃場からサンプリングした異なる２タイプの土壌（灰色低地土ならびに黒ボク土）に、食品製造残渣や油粕等を原料として製造された粒状有機質肥料を添加して異なる土壌温度（20～30℃）、土壌水分（最大容水量の50～80%）の下で保温静置する室内系土壌ミクロコズムを作成した。保温静置開始後、経時的に土壌ミクロコズムからガスを採取してECD-GCを用いてN2Oフラックスを測定した。土壌温度30℃、土壌水分として最大容水量の60～80%の条件下で保温静置した場合に、静置開始後10日前後にピークを示すN2Oフラックスが得られることが分かった。また、用いる土壌や粒状有機質肥料の粒径、土壌水分調整の間隔もN2Oフラックスに影響を与えることも見出された。
N2Oが発生している土壌から土壌DNAとRNAを抽出して脱窒機能遺伝子（nirK, nirSならびにnosZ）を対象とした（逆転写）PCR－シーケンス解析を行ってN2Oの生成と消去に関わる微生物を明らかにする計画である。そのために、土壌からの土壌DNA, RNA抽出の予備試験を行った。灰色低地度からは市販のキットを用いて、PCR解析を行うのに十分な純度の土壌DNAならびに RNAを抽出できることが分かった。一方、黒ボク土からは市販のキットを用いて土壌DNAは抽出できるものの、RNAの抽出は困難であった。そのため、黒ボク土からのRNA抽出法として報告されているWangら（2012）の方法を試したところ、RNAが抽出できる可能性が示されたが、安定的な抽出のためには再検討が必要であると判断された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今後の研究に用いる土壌ミクロコズムの作成方法と保温静置の最適な条件を決定することができた。灰色低地土については土壌DNA, RNAともに抽出でき、今後の研究の遂行に問題ないことが分かった。黒ボク土については土壌DNAの抽出は問題ないものの土壌RNAの抽出がやや困難であると分かったので、土壌DNAの解析を進めつつ土壌RNA抽出法を再検討する。

Strategy for Future Research Activity

N2O発生が見られる時期の土壌ミクロコズムの土壌から土壌DNAならびにRNAを抽出し、脱窒機能遺伝子を対象として（逆転写）定量PCRを行う。PCR産物のシーケンス解析を行い、脱窒機能遺伝子の持ち主の微生物を特定する。これにより、N2O生成と消去を担っている微生物群を明らかにする。