2005 Fiscal Year Annual Research Report

P型イオンポンプによる能動輸送機構の構造的解明

Research Project

Project/Area Number	14GS0308
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	豊島近東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (70172210)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	杉田有冶東京大学, 分子細胞生物学研究所, 講師 (80311190) 津田岳夫東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (10345233) 木寺詔紀横浜市立大学, 大学院総合理学研究科, 教授 (00186280) 鈴木裕旭川医科大学, 医学部, 教授 (50183421)
Keywords	生物物理 / 能動輸送 / 膜蛋白質 / イオンポンプ / X線結晶解析 / ATPase
Research Abstract	本研究の第一の目標は筋小胞体カルシウムATPaseのすべての構造をX線構造解析により決定することである。昨年度までに4つの基本状態の構造を決定することに成功した。今年度は分解能の向上と阻害剤を結合した構造の決定に力を注いだ。その結果、これまでに決定したthapsigargin(TG)に加えて蛍光TG,BHQ,CPAを結合した構造を決定でき、さらに阻害剤を組み合わせることによって分解能を向上させることに成功した。この結果、すべての阻害剤の結合部位は異なり、さらにCPAを結合したカルシウムATPaseの構造は他の2つとは異なっていることが示された。この結果、E2状態におけるカルシウムATPaseの構造が複数あることが、初めて直接的に明らかになった。また、E2状態でもATPは結合できることが生化学的実験から示されていたが、ATPのアナログであるAMPPCPを結合した構造を2.5Å分解能で決定でき、ATPの複数のコンフォメーションが明らかになった。本研究の第二の目標は分子動力学計算による構造変化の理解である。TGとBHQを組み合わせて2.5Å分解能で決定したE2状態のモデルを元にカルシウム結合部位の水素化確率を計算し、酸性残基の水素化がカルシウム放出後の構造の安定化に必須であること、それが無駄にしか見えない水素の対抗輸送の意味であることを明らかにし、PNASに発表した。さらに、結晶構造を得ることが著しく困難であるE2P状態とE1P状態、またカルシウム一個のみが結合した状態の構造を計算によって求めるため、分子動力学シミュレーションを行っている。そのため燐酸化アスパラギン酸のパラメータ決定を行い実際の計算を開始した。