2014 Fiscal Year Annual Research Report
生体応用を指向した低酸素環境検出蛍光プローブの開発
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14J00053
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
髙橋 翔大 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / 低酸素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低酸素環境はがんなど様々な疾患との関連が報告されており、低酸素環境を検出することはそのような病態の理解において重要である。炭酸脱水素酵素IX（CA IX）は低酸素環境下において発現が亢進するタンパク質の一つである。がんの浸潤の促進、成長因子の誘導などの作用を示し、低酸素環境のマーカーの一つとして広く知られている。これまで生物学研究においてCA IXは主に免疫染色によって検出されていたため、生きたサンプルでその発現を検出することは困難であった。一方、このタンパク質を認識して蛍光がoffからonへと変化する「蛍光プローブ」を開発することで、生きたまま簡便に低酸素環境部位を可視化することが可能とすることを目指した。
初年度である本年度は、蛍光プローブの分子設計法の確立を行った。ロドール骨格を蛍光団として用い、蛍光団の窒素原子に芳香環を直接導入することにより無蛍光性を示すことが知られている。この無蛍光性の原因は、分子内回転によるものだと考えている。また、CA IXへの結合部位となるスルホンアミド基を導入することにより、CA IXへの結合前には無蛍光性だが、CA IXへの結合によって分子内回転が抑制され、蛍光が上昇することを期待した。
このような化合物を20以上合成し、それらの光学特性を調べたところ、ベンゼン環の蛍光団に近い位置に導入する置換基が大きいほど高い蛍光量子収率を示すことが明らかとなった。これより、ベンゼン環部位の分子内回転を抑制することによって蛍光が回復することを狙った本分子設計が実現可能であることが示唆された。さらに、この中からCA IX結合時に10倍から30倍程度の大きい蛍光上昇を示す化合物を見出すことに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
初年度においては、蛍光プローブの分子設計法の確立とその原理に関する知見を得る計画だった。
まずは蛍光プローブの分子設計法の確立について、当初の予定通りに想定した機構によって蛍光特性の制御が可能であることが明らかとなった。すなわち、分子内回転により蛍光が消光する化合物を用い、CA IXへの結合リガンドを同分子に組み込むことにより、CA IX結合時に分子内回転が抑制され、蛍光が回復するという機構が実際に働くことを明らかにした。次に、その蛍光の消光と回復の原理について、芳香環に分子内回転を抑制するために大きな置換基を導入した化合物が非常に強い蛍光を示した。これは分子内回転を抑制することによって蛍光が回復することを強く示唆する結果だと言える。
さらに、20以上の化合物を合成することで、目的のCA IX結合時に大きな蛍光上昇を示す化合物を得ることができ、生細胞内において実際に低酸素環境で発現するCA IXの検出に成功しており、当初の計画以上に研究が進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、開発したCA IX検出蛍光プローブが実際に細胞、がんモデルマウスなどにおける実際の生体内の低酸素環境を検出可能かどうかを検討する。標的であるCA IX結合時に大きな蛍光上昇を示すことは明らかとなったが、実際の生体内にはその他様々なタンパク質が存在する。それらと比較し、標的であるCA IXにどれだけ選択的な応答を示すのかを明らかとする予定である。
また、蛍光プローブの構造展開により蛍光量子収率の改善を行う。これまでの検討により、開発したCA IX検出蛍光プローブはCA IX結合時の蛍光上昇は大きいものの、蛍光量子収率が低いため、イメージングを行うためには明るさが不十分であり、より高い蛍光量子収率を示す蛍光プローブの開発を行う。具体的には、様々な蛍光団を母核とした蛍光プローブを合成し、その蛍光特性を精査し、蛍光団による蛍光特性の違いに関する考察を行う。そのようにして得られた化合物の中から最適な蛍光団を選択し、さらに、CA IX結合部位の最適化により蛍光プローブの構造最適化を行う。
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