2014 Fiscal Year Annual Research Report
ジヒドロピラン架橋型新規人工核酸の合成および機能評価
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14J01415
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
大澤 昂志 大阪大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2016-03-31
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| Keywords | 核酸化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、架橋型核酸2’,4’-BNAを基盤とした新しい架橋型核酸の開発を通じて、核酸医薬の現状を打開するような革新的な人工核酸素材の開発し、日本発の核酸医薬品の創成を目指している。具体的には、ジヒドロピラン架橋型核酸およびその類縁体を新たに開発し、その物性、薬効評価を行う。その中で、本年度は以下の三つの内容を達成した。
1)「ジヒドロピラン架橋型核酸 (核酸塩基 = T) 修飾オリゴヌクレオチドの合成」市販品の5-メチルウリジンから10工程を経てジヒドロピラン架橋型核酸を合成した後、本人工核酸を導入したオリゴヌクレオチドの合成を行った。しかし、研究当初から懸念されていたように、3価のリンの酸化条件 (ヨウ素酸化) に対する安定性に問題があった。そこで、tert-ブチルヒドロペルオキシドを酸化剤として用いることで、オリゴヌクレオチドの合成を達成した。
2)「オリゴヌクレオチドの二重鎖形成能評価」合成したオリゴヌクレオチドについて、相補鎖RNAに対する結合親和性を融解温度 (Tm) 測定により評価した。その結果、天然のDNAと比較して、ジヒドロピラン架橋型核酸で修飾したオリゴヌクレオチドは、一修飾あたり4度から4.7度の大幅なTm値の上昇が見られ、非常に優れたRNA結合親和性を有することが分かった。
3)「オリゴヌクレオチドの核酸分解酵素耐性能評価」ジヒドロピラン架橋型核酸で修飾したオリゴヌクレオチドと、比較として天然のオリゴヌクレオチドと六員環架橋型核酸ENAで修飾したオリゴヌクレオチドを用いて酵素耐性実験を行った。その結果、天然のオリゴヌクレオチドと比較して、ジヒドロピラン架橋型核酸で修飾したオリゴヌクレオチドより高い核酸分解酵素耐性能を有していることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
現在までの架橋型核酸をはじめとした人工核酸の研究開発では、「分子の設計」、「合成」、「機能性評価」、「考察からの分子設計の見直し (フィードバック) 」という非常に長いスパンでのサイクルを繰り返す非常に時間を無駄にするものである。特にその中でも、人工核酸の「合成」が、出発物質から20～30工程かかることが一般的であることから、最も時間を割かれるケースが多い。しかし、本研究では、市販品の5-メチルウリジンを出発物質として用いることで、10工程という非常に短い工程数でジヒドロピラン架橋型核酸の合成を達成したため、スムーズにオリゴヌクレオチドの合成と、その基礎的な物性(二重鎖形成能と核酸分解酵素耐性能)の評価を行うことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ジヒドロピラン架橋部の高い求電子性を利用し、架橋環部の置換基導入を検討し、より優れた架橋型核酸アナログを見出す。
また、ジヒドロピラン架橋型核酸の核酸医薬としての可能性を精査するために、申請者が所属する研究室で確立している手法にてジヒドロピラン架橋型BNA修飾オリゴヌクレオチドのin vitro薬効評価を行う。In vitro薬効評価では、脂質異常症の治療標的とされるアポリポタンパクの一種ApoBをコードする遺伝子を標的にするアンチセンス核酸をヒト肝細胞由来細胞Huh-7へ導入し、ApoB mRNAの発現量を定量することで遺伝子発現抑制効果を調べる。
一方、核酸医薬にするという観点で、核酸塩基がピリミジン塩基 (5-Me-CおよびT) のみでは対象にできる遺伝子配列が著しく制限される。そこで、培養細胞評価系実験で特に優れた結果が得られたアナログについては、そのアデノシン (A) 体およびグアノシン (G) 体の合成も順次行うことで、その実用的な価値をより高める。
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