2014 Fiscal Year Annual Research Report
阻害剤開発の基盤構築を目指した薬剤排出トランスポーターのＸ線結晶構造解析
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14J01576
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
林 克彦 大阪大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | X線結晶構造解析 / トランスポーター / 多剤耐性菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多剤耐性菌感染症の克服に向け、菌の薬剤耐性獲得および菌の毒性発現への関与が明らかになりつつある薬剤排出トランスポーターの阻害剤開発を目指し、次の３つを目標にしている。（1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析 2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析 3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーター MacBの結晶構造解析）平成26年度は目標に対し次の事が明らかとなった。
1.MexY精製法・結晶化条件の変更により分解能の改善に成功した。精製用親和性タグのヒスタグをより長くし、一段階での精製を可能とした。加えて可溶化に用いる界面活性剤をn-Undecyl-β-D-maltosideへ変更した。結晶化条件を調べた結果、形の良い結晶が得られ実験室レベルのX線回折装置で8Å分解能を達成した。条件調整により、大きく形の良いMexY結晶を得ることで、ポリペプチド主鎖の配置同定が可能な分解能での構造解析が期待される。
2.AcrBとAcrAの結合比率を1:1に固定したAcrB-AcrA融合たんぱく質の解析を進めると、AcrB部位のみが発現したものが含まれることが判明した。融合たんぱく質の膜貫通リンカーとしてAcrB第7膜貫通ヘリックスを使用すると大幅に改善し、かつ融合たんぱく質は十分な排出活性を維持していた。更に膜貫通リンカーへ直結するAcrBのC末をより短くし、最適化した。この最適化した融合たんぱく質はAcrAの揺らぎが大きく制限され、かつ十分な排出機能を保持するので、AcrAの機能に必要な結合位置が予測でき、予測位置は過去文献とも一致した。また位置制限した事は結晶化に有利である事を意味し、AcrAB二者複合体の構造解明が期待される。
3.MacBの大腸菌での発現系の問題点として、発現時に切断されている事が明らかとなった。MacBは二量体で発現するため、切断されたものもまた精製されてしまう。これを解消する方法の考案が必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析 2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析 3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーター MacBの結晶構造解析、についてそれぞれ記述する。
1.MexY精製法で一段階での精製を可能とした点は、二年目の計画を含み、研究計画以上に進んだ点と考える。タグの伸長は結晶化条件に影響しなかった。精製時間の短縮とステップ数の軽減は結晶化用膜タンパク質標品の調整に有利と考えられる。これまで分解能はSpring 8で得られた7Å分解能が最高であった。大型放射光施設SPring 8 ではX線ビームの強度と直進性に優れており、今回得られた実験室系のX線回折装置での8Å分解能は、SPring 8ではより高い分解能が期待できる。以前の結晶よりも質は格段に向上しており、結晶化条件を最適化することでポリペプチド鎖を同定し構造解析が可能になる可能性が高い。以上から順調に進行していると考える。
2.引き続き構造解析を目指してAcrB-AcrA融合タンパク質の結晶化を行う予定だが、計画通りに融合タンパク質の最適化を達成できた点は、結晶化に向けて大きく前進した点で意義が大きい。また、AcrB表面のAcrAの結合位置が予測できた事は未解明のAcrAB-TolC三者複合体の機能する状態の構造予測及び解明に向けた重要な情報である。クライオ電子顕微鏡で得られた三者複合体構造とはモードの違う複合体構造の可能性を強く示唆し、構造-機能相関の面でも意義は大きい。以上より、順調に進行していると考えられる。
3. 以前は発現時点でのMacBの切断は分かっておらず、大腸菌を使った系では改善しなかった。発現系にまで立ち戻った検討が必要であるが、MacBの可溶化に適した界面活性剤の候補は絞り込めており、発現系の問題を解決すれば結晶構造解析に向けて進展するものと考えられる。
以上から、総合すると、概ね順調に研究が進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析 、2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析、3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーター MacBの結晶構造解析、についてそれぞれ記す。
1.引き続きMexYの結晶化条件を探索していく。界面活性剤の変更で結晶成長に影響があった事から、MexYが溶けているミセルの大きさを制御する事で、より良い結晶を得る事が可能と考える。具体的にはDetergent Screening Kit等を試すことで、現行の界面活性剤との混合ミセルとすることにより制御する。結晶は大型放射光施設SPring 8のX線を使い構造解析する事を計画している。
2.AcrB-AcrA融合タンパク質の結晶条件探索を行い二者複合体の構造解析を目指す。融合タンパク質のAcrA部位のうち、TolCと結合する部位は構造が揺らぎやすく結晶化には不利と考えられるので、この部位を遺伝子工学的手法で欠失させた融合タンパク質を構築し結晶化する。AcrA部位の残りの部位はAcrBとの結合が確認されており、一部を欠失させた融合タンパク質であっても、二者複合体の排出機能は十分に議論が可能と考えられる。また、三者複合体の結晶構造解析に向けて、AcrB-AcrA-TolC融合タンパク質(AcrB-linker-AcrA-linker-TolC)を構築し、機能がある場合にはこれの結晶化を行う。その他、二者融合タンパク質との共結晶化を目指し、外膜に発現したTolCの精製法を確立する。TolCの大量発現系は既に存在している。
3.MacBの発現時に断片化する問題を解消するため、MacAとの共発現による保護を試みる。MacAは六量体を形成しMacBを囲むように存在すると考えられ、MacBを切断から保護できる可能性がある。この他、ProteoLiposome Expression Kit等のコムギ無細胞発現系でリポソーム中に発現させ、完全な二量体の発現を試みる。また、より安定して可溶化できる界面活性剤を探索する。
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Research Products
(5 results)
