2015 Fiscal Year Annual Research Report
線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓを用いた神経回路における忘却促進の分子メカニズム
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14J01655
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
北園 智弘 九州大学, システム生命科学府, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 記憶 / 忘却 / 匂い / 線虫 / p38/MAPK / 遺伝学 / 行動可塑性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では記憶の忘却の分子機構を明らかにするために、線虫C. elegansにおける嗅覚順応をモデルとして解析を進めている。先行研究において、TIR-1/JNK-1経路が嗅覚順応の忘却を促進することが明らかになっている（Inoue, A. et al., 2013）。本研究では、忘却を促進する分子機構において、この経路の下流を明らかにするために、tir-1機能獲得型変異体のサプレッサー変異体をスクリーニングにより探索し、解析を行なっている。
スクリーニングによって得られたサプレッサー変異体のうち、１系統の原因遺伝子が、膜タンパク質をコードしている遺伝子であることを、昨年度までに同定していた。本年度はこの膜タンパク質の変異体について、細胞特異的表現型回復実験を行うことにより、膜タンパク質が複数のニューロンで機能している可能性が高いことを明らかにした。また、さらに別の１系統のサプレッサー変異体については、昨年度までに原因遺伝子が、受容体チロシンキナーゼをコードしていることを明らかにしていた。本年度は、CRISPR/CAS9システムを用いて、受容体チロシンキナーゼの発現が神経系特異的に阻害されると、嗅覚順応の忘却が抑制されることを明らかにした。これらに加えて、本年度は、新たに１系統、別のサプレッサー変異体についても、原因遺伝子の候補を６つにまで絞ることができた。
先行研究において、TIR-1/JNK-1経路の活性化により、AWC感覚神経から神経分泌が行われることで、忘却が促進することが明らかになっている（Inoue, A. et al., 2013）。しかし、このニューロンが学習と忘却の過程において、どのタイミングで機能しているのかは明らかになっていない。これを明らかにするため、ヒスタミン作動性Cl-チャネルを用いて、時期特異的にAWCニューロンの機能を阻害するという実験系の開発を試み、一部成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の最初の目標は、スクリーニングにより得られたtir-1機能獲得型変異体のサプレッサー変異体について、SNPマッピングと全ゲノムシークエンシングを組み合わせることによって、原因遺伝子を明らかにすることである。今年度は、全ゲノムシークエンシングを行なった20株のサプレッサー変異体のうち、新たに１株について、原因遺伝子の候補を６つにまで絞っており、来年度中に同定できることが期待される。
本研究の最終的な目標は、同定した新規因子の上下流の因子や、この因子が働く神経細胞を明らかにすることによって、TIR-1/JNK-1経路の下流で働くシグナル伝達経路や神経回路を解明することである。今年度は、昨年度までに同定した２つの新規因子について、細胞特異的表現型回復実験、および、CRISPR/CAS9システムを用いた細胞特異的な遺伝子のノックアウトを行うことで、それぞれが機能する神経細胞が絞れてきている。この結果からTIR-1/JNK-1経路の下流の神経回路が明らかになりつつある。
本研究で解析している受容体チロシンキナーゼの変異体に、野生型遺伝子を導入した株を作製することは困難であったためは行動異常を示すことが多く、昨年度までは、この受容体チロシンキナーゼが線虫の体のどの部位で機能しているのかを明らかにすることは困難であった。しかし、本年度は前述のCRISPR/CAS9を用いた手法を導入したことにより、この受容体チロシンキナーゼが機能する神経細胞の同定を行うことが可能になった。今後は、このように今まで細胞特異的表現型回復実験が困難だった変異体についても、この手法を用いて解析することができると期待される。
さらに、本年度は、ヒスタミン作動性Cl-チャネルを用いて時期特異的に神経細胞の機能を阻害する手法において、期待した結果が得られていることから、記憶の忘却を制御する神経回路の機構を、時間を追って解析することができると期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.原因遺伝子の同定が完了していないサプレッサー変異体については、SNPマッピングと行動実験を組み合わせた原因遺伝子の同定を続行する。また、変異体の解析によって明らかになった新規因子について、細胞特異的表現型回復実験を行うことにより、それぞれがどの神経細胞で働いているのかを明らかにする。
2.すでに同定した因子や新たに同定した因子について、エピスタシス解析を行うことで、それぞれの因子が働く順番を推定する。また、それぞれの変異体のいくつかの匂い物質に対する嗅覚順応の忘却や、新たに同定した因子の既知の関連因子の変異体の忘却について、行動実験を用いて解析を行う。これらの解析結果を組み合わせることで、忘却の制御機構において、TIR-1/JNK-1経路の下流のシグナル伝達経路の全容を明らかにする。
3.TIR-1/JNK-1経路が働いていることが明らかになっているAWC感覚神経や、新たに同定した新規因子が働く神経細胞について、ヒスタミン作動性Cl-チャネルを用いて、学習と忘却の過程の様々なタイミングにおいて、人為的に活動を抑制することにより、それぞれの神経細胞が学習と忘却の過程のどこで働いているかを調べる。これにより、忘却を制御する神経回路を明らかにする。
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Research Products
(2 results)
