2014 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質Ｎ末端アセチル化による選択的ミトコンドリア分解の制御
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14J01682
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
英山 明慶 大阪大学, 生命機能研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / マイトファジー / オートファジー / タンパク質N末端アセチル化 / 出芽酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は選択的ミトコンドリア分解(マイトファジー)のメカニズムの解明を目的としている。その中で、新規のマイトファジー制御因子の候補である、タンパク質N末端アセチル化酵素NatAとマイトファジーの関係性について解析を行っている。
過去の解析により、NatAを欠損させた出芽酵母の細胞では、ミトコンドリアの分解が強く抑制されることはわかっていた。しかし、この分解抑制が、ミトコンドリアの液胞内へ取り込みが抑制されているかどうかは確認していなかった。そこで、ミトコンドリアの液胞への取り込みを調べるため、蛍光顕微鏡を用いた解析を行った。結果として、NatAを欠損させた細胞では、ミトコンドリアの液胞への取り込みは確認できなかった。よって、NatAがマイトファジーに影響するタイミングは、液胞への取り込み以前であるということが判明した。
さらに、NatA欠損細胞ではマイトファジーの必須因子であるAtg32の発現誘導が部分的に抑制されることを確認し、特に転写レベルにおいて、ATG32のmRNAの発現レベルが顕著に減少していることがわかった。よって、NatAがAtg32の転写制御に関与している可能性が非常に高くなった。
次に、NatA欠損細胞において、他のオートファジー関連経路への影響を調べた結果、バルクオートファジーや、タンパク質の選択的オートファジーであるCvt pathwayに関しては大きな影響は確認できなかった。一方で、ペルオキシソームを選択的に分解するペキソファジーは抑制されることを確認した。ミトコンドリアとペルオキシソームというオルガネラの分解が抑制されたことから、NatA欠損はオルガネラの選択的オートファジー共通の制御システムに、何らかの影響を及ぼしている可能性が考えられる。
本年度の研究により、NatAがマイトファジーに関与していることがより確からしくなり、詳細な知見を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
マイトファジーに重要な役割を果たすNatAとその欠損変異体の解析を進めた結果、詳細な知見と新たな知見の両方を得ることができ、今後の研究をより具体的な方向へと推し進めることが可能となった。
NatA欠損細胞において、ミトコンドリアの液胞への取り込みが確認できなかったことから、NatAがマイトファジーの初期段階に関与していることが示唆された。このことから、今後の解析範囲を限定することができたと考える。また、マイトファジーの必須因子Atg32の発現制御に、NatAが関与していることを見出し、特に転写制御に関与していることが示唆された。よって、今後はATG32の転写制御に絞った解析を行うことができる。さらに、NatAがペルオキシソームの分解に重要であることを明らかにしたことにより、これまでに知られていない、オルガネラを分解する共通原理の解明につながる可能性もでてきた。
以上のように、当初の目的に沿ったNatAによるマイトファジー制御の解明に関する研究は順調に進んでおり、今後はより的を絞った研究を展開することができる。それと同時に、新たな可能性を示唆した結果が得られたことで、本研究が当初の目的のみだけでなく、今後、新たな研究テーマに派生できる可能性を秘めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
NatAがマイトファジーのどの段階に影響を及ぼしているのかを更に詳細に解析するため、ミトコンドリアが細胞質内で隔離膜に囲まれるマイトファゴソームの形成の有無について解析を行う。NatA欠損細胞で、マイトファゴソームが確認されれば、NatAはマイトファゴソームと液胞の融合に関与するとわかる。反対にマイトファゴソームが確認できなければ、隔離膜の形成の制御に関与している可能性がある。これらがわかることで、マイトファジーのどの制御系を解析すればよいかさらに絞り込むことができる。
NatAのアセチル化の標的となるタンパク質は、出芽酵母では全タンパク質の半分以上だと言われており、Atg32以外にマイトファジーとNatAを繋ぐ因子を同定するためには、網羅的な解析が欠かせない。そこで、野生型、NatA欠損細胞、NatAの触媒サブユニットArd1に変異を入れた細胞から、それぞれミトコンドリアを単離し、そこに局在するタンパク質に注目した準網羅的な解析を行う予定である。質量分析と2次元電気泳動法による解析を行い、NatAの存在下、非存在下によって発現レベルが変動しているタンパク質と、2次元電気泳動によってNatAからアセチル化を受けているタンパク質の同定を行う。
Atg32の発現誘導について、最近、ATG32の転写の抑制因子として、Sin3-Rpd3-Ume6複合体が報告されている。今後、NatAとこれら因子の関わりについても解析を行う予定である。また、Atg32は呼吸増殖が進むにつれ発現レベルが上昇するが、24時間を過ぎた頃には急激に減少し始める。この減少制御のメカニズムも明らかにっておらず、NatA欠損時に減少制御が増強されている可能性もあるため、発現制御だけでなく、Atg32の減少制御についても解析を行う。加えて、Atg32の発現制御以外の機能解析(局在、相互作用など)も行う。
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