2014 Fiscal Year Annual Research Report
染色体の高次構造解析を用いた多能性獲得機構における遺伝子発現制御システムの解明
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14J01800
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Research Institution | Kyoto University |
Principal Investigator |
池田 宏輝 京都大学, iPS細胞研究所, 特別研究員(DC2)
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Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2016-03-31
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Keywords | 3C / 染色体相互作用 / iPS細胞 |
Outline of Annual Research Achievements |
4C-Seqは着目したゲノム領域(ベイト領域)と相互作用するゲノム領域を網羅的に同定することのできる手法である。まず、エンハンサー領域、及び遺伝子のプロモーター領域の46ヶ所 をベイト領域として選出した。従来の4C-Seqには制限酵素処理とライゲーション反応を用いて3C ライブラリを環状化する工程がある。前述の行程では制限酵素の認識配列の偏りによってバイアスがかかる。このバイアスの影響を少なくするため、超音波を用いたDNAのランダムな断片化手法へと変更した。また、一度に多くのベイト領域についてサンプルを調整するため、ユニバーサルアダプターによるマルチプレックスPCRを用いた手法へと改良した。 当該4C-Seqを用いて体細胞(HDF)とiPS細胞におけるクロマチン相互作用の比較を行った。 改良した手法が染色体の相互作用を検出できているかを確認するため、3D DNA FISHを用いて、単一細胞における遺伝子座の核内局在の解析を行ったところ、4C-Seqと同様の結果が得られた。続いて、クロマチンの相互作用頻度を細胞初期化の前後で比較したところ、遺伝子発現を伴わないゲノム領域であってもクロマチンの相互作用が再構成されることが示唆された。また、iPS細胞では分化関連遺伝子が共局在する頻度が高くなる傾向にあることが分かった。 検出された分化関連遺伝子の共局在の形成に必要な因子の探索を目的として、相互作用領域に濃縮しているタンパク質を標的としたshRNAを作製し、遺伝子のノックダウン実験を行った。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度は、先行論文と公共データベースの情報を基にエンハンサー領域やプロモーター領域をクロマチン相互作用解析の対象ベイト領域として選定した。さらに、iPS細胞と体細胞の染色体相互作用を解析し、iPS細胞特異的な相互作用を検出することができた。当初期待していたエンハンサー領域については相互作用の特徴的な変化を検出できていないが、本解析によって分化関連遺伝子のプロモーター領域では、細胞の初期化によって特徴的なクロマチン相互作用が形成されることが示唆された。また、4C-Seqによって検出された相互作用の確認をするため、3D DNA FISH を用いて、単一細胞の核内における遺伝子座の局在を解析したところ、4C-Seqと同様の結果を得た。 ChIP-Seqのデータを基に、相互作用領域のクロマチンの状態を調べた。その結果、iPS細胞ではH3K4me3やH3K27me3、そのヒストン修飾を担うタンパク質群がクロマチンの相互作用領域に濃縮することが分かった。現在、これらのタンパク質がクロマチンの構造形成に関与しているかを調べるため、shRNAを作製し、遺伝子のノックダウン実験を行っている。 昨年度は、予想と合致するエンハンサーの相互作用変化は見いだせなかったものの、興味深いクロマチンの相互作用が検出された。また、本年度行う計画であったDNA FISHによる解析、機能阻害実験による、相互作用形成に必要なタンパク質の同定実験に着手しているため、概ね順調に進展していると考えられる。
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Strategy for Future Research Activity |
当初はエンハンサー領域におけるクロマチン相互作用の解析を対象にした研究計画を立てていたが、多能性遺伝子NanogやPou5f1等のエンハンサー領域の相互作用についていくつかの論文が発表された。そこで本年度は、現在同定できているiPS細胞に特徴的な遺伝子座の相互作用について重点をおいて調べ、その形成機構、多能性獲得機構との関係性に対する知見を得たい。 昨年度に同定した体細胞の初期化によって形成されるクロマチンの相互作用に必要なタンパク質を探すため、相互作用領域に濃縮されていたH3K4me3/H3K27me3の修飾に関わるタンパク質を標的としたshRNAを用いて遺伝子のノックダウンを行い、染色体の相互作用がどう変化するかを調べる。本実験により、クロマチンの相互作用形成における、当該タンパク質の必要性を評価する。 また、上述した遺伝子のノックダウンによって、相互作用領域のヒストン修飾が変化することが予想される。ChIP-qPCRを用いて相互作用領域にあるヒストン修飾がその修飾を担う遺伝子のノックダウンによって減少しているかを調べ、このヒストン修飾がクロマチンの相互作用形成に必要であるのか検討したい。
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Research Products
(1 results)