2014 Fiscal Year Annual Research Report

細胞内ミトコンドリア輸送システムを利用した核酸送達キャリアの開発

Research Project

Project/Area Number	14J02379
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	河村恵理子北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2014-04-25 – 2017-03-31
Keywords	薬学 / ミトコンドリア / 薬物送達システム / 細胞内動態 / アンチセンスRNA
Outline of Annual Research Achievements	本申請研究では、細胞内動態を制御したミトコンドリア（Mt）標的型核酸送達システムの構築を目的とする。平成26年度は、下記の項目を中心に研究を遂行した。１．細胞内骨格を介してMtへ移行するキャリアの構築 Mt標的型キャリア、MITO-Porterは、静電的相互作用を利用して薬物をMtに送達するが、Mt膜電位の低下した疾患細胞を標的とした際にはMt移行能が低下することが懸念された。電荷によらない送達戦略を用いたキャリアを構築するため、微小管輸送に関連するモータータンパク質、キネシンに結合するタンパク質のペプチド配列を選択し、MITO-Porterに修飾したキャリアを構築した。しかし、細胞への取り込みが非常に低かったため、細胞膜親和性を有する脂質エンベロープ膜に内封し、多重型にパッケージングすることにより、取り込み量を飛躍的に増加させることに成功した。さらに、キャリアに搭載した核酸の細胞内Mt送達量をqRT-PCRを用いて定量的に算出する評価系を構築したため、今後新しく構築したキャリアを用いた評価を遂行する。２．Mtへの核酸送達量を検証する評価系の確立 Mt内への核酸送達による機能を評価するため、mtDNAにコードされた呼吸鎖複合体IVのサブユニットCOX2を標的としたアンチセンスRNAを使用した。従来のMITO-Porterを毒性の観点より改良し、ポチカチオンを用いた核酸ナノ粒子をキャリアに内封することにより、脂質投与量を10分の1に減少させることに成功した。さらに、Mt内部におけるアンチセンス効果を検証した結果、コントロール配列と比較し標的mRNA発現量の抑制、Mt膜電位の低下、ATP産生量の低下を確認した。これらの結果よりMITO-Porterを用いて核酸をMtに送達することにより、Mt内におけるアンチセンス効果が引き起こされたことが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 細胞内骨格を利用することにより細胞内動態を制御したキャリアを構築することを目的とし、キネシン結合タンパク質由来のペプチド配列をMITO-Porterに修飾したキャリアを構築した。さらにキャリアを多重型にパッケージングすることにより、飛躍的に細胞内取り込みを上昇させた。ミトコンドリア選択的なキネシン結合タンパク質のTRAK1をコードしたプラスミドDNAを構築したが、現在タンパク質の発現、精製を検討中である。そのため、今年度構築した細胞内ミトコンドリアへの核酸到達量を定量的に算出する評価系を用いて、次年度にTRAK1のミトコンドリア標的能を詳細に検証していく予定である。一方、アンチセンスRNAを用いたMITO-Porterによるミトコンドリアへの核酸送達能評価に関しては、細胞毒性を軽減したキャリアを構築することにより、次年度に行う予定であったアンチセンス効果による標的mRNA発現量の抑制、ミトコンドリア膜電位の低下、ATP産生量の低下を確認することに成功した。
Strategy for Future Research Activity	平成27年度は今年度に引き続き、細胞内骨格を利用したミトコンドリア送達キャリアの構築を進める。キネシン結合ペプチドを修飾したキャリアに関しては、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いた細胞内動態観察、また今年度構築した評価系を用いてミトコンドリア核酸送達能評価を進める。さらに、今年度ミトコンドリア病患者由来の疾患細胞を扱うことが可能となり、MITO-Porterをミトコンドリアへ送達可能であることを確認したため、新しく構築したキャリアの疾患細胞における細胞内動態を検証する。今年度はMITO-Porterを用いたアンチセンスRNAのミトコンドリア送達によるノックダウン効果を検証したが、平成27年度はアンチセンスRNAによる効果を高めるために新しく設計したアンチセンスRNA配列の効果を検証する。さらに、標的としたミトコンドリアmRNA選択的に働いていることを示すため、より詳細なミトコンドリア機能評価を進める。さらに、疾患細胞のミトコンドリアへの機能性核酸の送達を試みる。