2014 Fiscal Year Annual Research Report

質量顕微鏡法による精神神経疾患脳における脂質‐炎症相互連関の解明

Research Project

Project/Area Number	14J05334
Research Institution	Hamamatsu University School of Medicine
Principal Investigator	近藤豪浜松医科大学, 医学部, 特別研究員(PD)
Project Period (FY)	2014-04-25 – 2017-03-31
Keywords	脳神経疾患 / リピドミクス / 自然免疫学 / ゲノム編集
Outline of Annual Research Achievements	精神神経疾患の発症・増悪の分子メカニズムを、脳内メタボロームと炎症応答が与える影響の面から解明することを目的とし、統合失調症とアルツハイマー病を対象として研究を開始した。統合失調症については作用機序が不明である治療薬の作用メカニズムを明らかにする視点で研究を進めた。質量顕微鏡法の新たな応用手法により、治療薬と高い親和性をもつ分子群をマウス脳内から新たに同定した。予備実験から研究開始当初に想定していたものとは別の、より神経機能への直接的影響が強いと思われる分子種であるため、現在はこちらに焦点を当てている。同定分子種のマウス脳内分布のイメージングも成功し、統合失調症の病態に重要とされる大脳皮質に注目して、治療薬投与による変化を現在解析中である。アルツハイマー病については、p47タンパク質の機能解明を中心に進めている。細胞内膜輸送との関係性を明らかにするためp47結合タンパク質の探索を行い、同定した候補分子との細胞内結合を免疫沈降法や蛍光染色により確認した。一方でSTING凝集体を除去する機構については、これまでのデータと他のグループの最新報告を併せて考えるとユビキチンシステムが主であると思われ、p47ノックダウン細胞でオートファゴソーム形成が亢進する現象は、おそらく小胞体ストレスの亢進による二次的現象と考えている。神経系での機能を評価するためにCRISPR-Cas9システムを用いたノックアウトマウスの作製を進めた。準備として過去に電気生理学実験に用いられていた機器をマイクロインジェクション用に確保した。また生理学研究所のトレーニングコースに参加し、実際の操作技術について学んだ。浜松医大内の承認手続きも完了したので、今年度は実際に作製を開始する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 統合失調症プロジェクトについては、解析条件の改善と得られたデータの精査により、予備検討時点とは別の向精神薬標的候補を同定した。神経系でこれまで知られている機能や共同研究で得られつつある知見と併せても興味深い結果であり、既存治療薬の新規作用メカニズムの提唱と今後の治療薬開発につながることが期待できる。候補分子が当初と変わったこともあり、細胞やマウス体内での変化についての検証が途上であることから「概ね順調」とした。アルツハイマー病プロジェクトについては、細胞生物学的、生化学的実験において新たな知見が集積し、p47タンパク質の機能の詳細が明らかになりつつある。特に小胞体ストレスに影響する可能性を認めたことで、神経疾患のみならず様々な病態に寄与することが考えられ、当初想定していたよりも大きな生物学的意義が期待される。こちらも当初の想定外に展開したため、論文に今後追加で必要となる解析を考慮すると、現時点での達成度は不十分であるため「概ね順調」とした。そのほか、CRISPR/Cas9システムも準備は予定通り進んでいるが（平成２６年度は準備期間）、ノックアウトマウスの作出には至っていない、筆頭で論文・学会発表に至っていないため、全体を通しても「概ね順調」が妥当と考える。
Strategy for Future Research Activity	統合失調症プロジェクトについては、治療薬と標的分子の親和性を別の方法で（円二色性か表面プラズモンに基づく方法を検討中）評価するほか、細胞内やマウス脳内における薬物投与後の変化について質量分析（MALDI-IMS、LC-MS）を用いて検証する。ある程度の科学的証拠が揃った時点で論文化を検討し、分子生物学的手法による詳細なメカニズムの解明や新たにノックアウトマウス等の準備を要する実験については、続報として発表することも考慮する。アルツハイマー病プロジェクトについては、p47と小胞体ストレスの関係性に焦点を当てた実験を追加する。CRISPR/Cas9システムによるp47ノックアウト細胞株において、炎症シグナル活性時の小胞体ストレスの亢進や細胞死の誘発を確認する。可能であればp47ノックアウトマウスを作製しin vivoで重要性を裏付けたいところであるが、マウス作製の進行状況に依るため、in vitroのデータのみでひとまず報告することも考える。