2014 Fiscal Year Annual Research Report
変形性関節症におけるＥｘｏｓｏｍｅの役割と治療応用
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14J05729
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
石飛 博之 広島大学, 病院(医), 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 変形性関節症 / Exosome / microRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
変形性関節症(以下、OA)は分子機構の解明の遅れから根本的治療は存在していない。我が国では約1000万人ものOA罹患者の存在が示唆され、今後、更なる高齢化に伴い罹患者の増加が予想される。そこで、未知のOAの分子機構を解明し、新たな治療法や診断マーカーとなる分子の発見に繋げる必要がある。我々は、新たなOA発症の分子機構として、microRNA(以下、miRNA)を含むExosomeに着目している。我々の研究室では、軟骨で高発現するmiRNAがOA発症に関与していることを明らかにしている(Miyaki S et al.,2010 Genes Dev)。また、miRNAはExosomeという微小胞に包まれることで細胞外へ分泌し、標的細胞内へ取込まれ機能することが報告されている。これらの報告から、OAにおいてExosomeによる分泌型miRNAが関節構成組織間で作用し、血管新生や軟骨変性などを引き起こすという仮説をたて研究を行っている。これまでに、健常者由来滑膜細胞に比べ、IL-1β刺激下のOA様滑膜細胞の培養上清より精製したExosomeは、血管新生能、軟骨変性能があることを明らかにし報告した（Kato T et al.,2014）。しかし、これらの現象はExosome中のどのような分子によるものかは不明である。また、我々は、目的の合成miRNAを細胞に過剰に導入することでExosome型のmiRNAとして分泌できること、そのExosomeを別の細胞に添加すると容易に細胞内に取り込まれ機能することを報告した(Shimbo K et al ., 2014 BBRC)。そこで、本年度は、IL-1β刺激下のExosome分泌量、責任分子の検討等を含むExosomeの機能解析、及びExosome型miRNAによるOA治療へ応用することを新たな課題として加え、検討することを目的とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. IL-1β刺激下、ヒト滑膜細胞由来Exosomeの解析
IL-1β刺激によりOA様滑膜細胞からExosomeを採取し、分泌量を検討したところ、IL1-β刺激により、Exosomeの粒子数が増加したこと、また、表面マーカーの発現が増加したことから、OA様滑膜細胞においてはExosomeの分泌量が増加することが明らかとなった。次に、Exosome中のどのような分子が血管新生能や軟骨変性能を引き起こすのか検討した。Exosomeを超遠心法によりExosome層とExosomeを除いた上層に分離し、解析を行った。IL-1β刺激した滑膜細胞由来のExosomeを除いた上層に比べ、Exosome中で発現が顕著に増加していたmiRNAを5つ同定した。これらmiRNAを一つずつ軟骨細胞に導入し、軟骨変性に関与する遺伝子の発現を解析した。軟骨変性に関与する遺伝子群の発現を誘導するような傾向はみられたが有意な差はなかった。
2. Exosome型miRNAによるOA治療効果の検討
軟骨の恒常性に重要な役割を果たすことが知られる、miRNA-140をヒト間葉系幹細胞に導入し、Exosome型miRNAとしてOAに対する治療効果を検討した。野生型マウスを用いて靭帯切除によるOAモデルを作製し、① Exosome型miRNA-140, ②Exosome型ネガティブコントロールmiRNA, ③ miRNA－140をアテロコラーゲン（コントロールキャリア）に混ぜた計3グループにわけ、週一回の関節注射を8週間に渡り行った。その結果、グループ②、③に比べ、Exosome型miRNA-140を投与したグループではOAの抑制が観察された。
以上の実験結果、及び、その他の実験も順調に進んでいることから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、Exosomeが低下した際のOAへの影響を試みている。Exosomeの表面マーカーであるCD9のノックアウト（KO）マウスではExosomeの分泌が低下していることが示唆されているため、Exosomeの分泌量の検討及び、一過性の炎症性関節炎モデル、靭帯切除によるOAモデルを用いて、Exosome低下によるOAへの影響を検討した。その結果、CD9 KOマウスの軟骨細胞より分泌するExosome量は、有意に分泌低下を示す結果を得られていない。また、過去の報告では、CD9KOマウスはインテグリン等との複合体が形成不全による血管新生促進能等の低下が示唆されること、Exosome分泌のみを低下させるといった報告も存在していないことから、Exosome分泌が低下したことによるOAへの影響を検討することが難しいことが予想される。そこで、今後は、OA時に分泌が予想されるmiRNAの働きを抑制すること、及び、Exosomeを利用した分泌miRNAによるOAへの治療効果に着目し研究を進めていく計画である。前者は、これまでの実験から、IL-1β刺激によりヒト滑膜細胞からはExosomeの分泌量が増加し、Exosome中に含まれるmiRNAが血管新生や軟骨変性を引き起こす可能性を見いだしている。しかし、ヒトのOA軟骨で分泌が予想されるmiRNAが過剰に発現し、機能しているかは明らかではない。そこで、OA様miRNAがヒトOA軟骨において発現し、血管新生能や軟骨変性能を有しているか検討を行う。後者は、Exosome型miRNA-140を投与したマウスはOAの抑制が観察されている。しかし、この現象のメカニズムについては不明であり、今後、OA治療にExosome型miRNAが応用可能かはさらに検討を進めていく必要がある。
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Research Products
(2 results)
