マダニの自然免疫関連膜受容体を標的としたバベシア原虫媒介阻止ワクチンの開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J05872
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 前田 大輝 山口大学, 連合獣医学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: マダニ / 人工吸血 / バベシア

Outline of Annual Research Achievements

昨年度はバベシア原虫媒介阻止ワクチン標的受容体としてフタトゲチマダニより新規のC型レクチンの同定および機能解析を行ったが、バベシア原虫に対する関与については未検証である。しかし、現状ではこのマダニの媒介原虫であるバベシア・オバタ(Bo) 感染実験が容易にできないウシを宿主とし、フタトゲチマダニ体内におけるBoの知見については不明な点が多い。そこで本年度は、フタトゲチマダニ体内におけるBoの挙動を明らかにすることを試みた。
本研究では人工吸血法を用いてBo感染マダニを作出し、Boβ-tubulin遺伝子を標的としてPCRまたqPCRによるマダニ体内のBo検出を行った。その結果、中腸においては飽血後0日目にはほぼすべてのサンプルにおいて原虫遺伝子断片が検出されたのに対して、飽血後4日目に向けて検出率が減少した。一方で、卵巣およびその他の臓器においては飽血後4日目に向けて検出率が増加した。検出されたBoを可視化するために、原虫細胞骨格蛋白質であるP29を標的に蛍光抗体法による検出を行った。BoP29ホモログのクローニングを行い、マウスを用いて特異的抗血清を得た。Bo感染マダニ組織切片を用いて蛍光抗体法を行ったところ、マダニ細胞の内外ともにBo特異的な蛍光を確認できた。またBo感染マダニ卵の圧平塗抹を用いて同様に検出を行ったところ、Boと思われる細胞を確認することができた。
以上の結果より、新規のBo人工感染マダニにおけるバベシア原虫感染率評価系を確立することができた。また本実験系を用いて、飽血後24時間以内に中腸を通過したバベシア原虫が、マダニベクターにおける経卵巣伝播の成立に寄与する可能性が明らかとなった。これらの成績は、バベシア原虫とマダニベクターとの相互関係を分子レベルで解析する上で重要な時間的指標となるものと考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年同定した新規の膜受容体とバベシア原虫の関連性を探るために新規の評価系を作製し、今まで不明であったフタトゲチマダニ体内におけるBo動態の一端を明らかにした。本成果により、マダニ体内でのバベシア原虫研究において新たな研究展開が期待される。

Strategy for Future Research Activity

本年度の成果により、人工吸血法を利用したマダニ－バベシア実験感染モデルを作製することができた。当初の計画では最終年度に犬を用いた感染実験を予定していたが、感染動物を用いず、より簡便で再現性のとりやすい本実験系を利用して、同定した膜受容体がバベシア原虫の伝播阻止ワクチン標的候補分子となりうるかを検証していく予定である。

Research Products

• [Journal Article] A novel C-type lectin with triple carbohydrate recognition domains has critical roles for the hard tick Haemaphysalis longicornis against Gram-negative bacteria. (2016)
  • Author(s): Maeda H, Miyata T, Kusakisako K, Galay RL, Talactac MR, Umemiya-Shirafuji R, Mochizuki M, Fujisaki K, Tanaka T.
  • Journal Title: Developmental & Comparative Immunology Volume: 57 Pages: 38-47
  • DOI: 10.1016/j.dci.2015.12.015
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Induction of gene silencing in Haemaphysalis longicornis ticks through immersion in double-stranded RNA. (2016)
  • Author(s): Galay RL, Hernandez EP, Talactac MR, Maeda H, Kusakisako K, Umemiya-Shirafuji R, Mochizuki M, Fujisaki K, Tanaka T.
  • Journal Title: Ticks and Tick-borne Diseases Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1016/j.ttbdis.2016.03.018.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Virucidal activity of Haemaphysalis longicornis longicin P4 peptide against tick-borne encephalitis virus surrogate Langat virus. (2016)
  • Author(s): Talactac MR, Yoshii K, Maeda H, Kusakisako K, Hernandez EP, Tsuji N, Fujisaki K, Galay RL, Tanaka T, Mochizuki M.
  • Journal Title: Parasites & vectors Volume: 9 Pages: 59
  • DOI: 10.1186/s13071-016-1344-5.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Improvement of the cryopreservation method for the Babesia gibsoni parasite by using commercial freezing media. (2016)
  • Author(s): Kusakisako K, Masatani T, Yada Y, Talactac MR, Hernandez EP, Maeda H, Mochizuki M, Tanaka T.
  • Journal Title: Parasitology International Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1016/j.parint.2016.02.012.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Functional analysis of recombinant 2-Cys peroxiredoxin from the hard tick Haemaphysalis longicornis. (2016)
  • Author(s): Kusakisako K, Masatani T, Miyata T, Galay RL, Maeda H, Talactac MR, Tsuji N, Mochizuki M, Fujisaki K, Tanaka T.
  • Journal Title: Insect molecular biology Volume: 25 Pages: 16-23
  • DOI: 10.1111/imb.12193.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Impaired cellular immune response to injected bacteria after knockdown of ferritin genes in the hard tick Haemaphysalis longicornis. (2016)
  • Author(s): Galay RL, Takechi R, Umemiya-Shirafuji R, Talactac MR, Maeda H, Kusakisako K, Mochizuki M, Fujisaki K, Tanaka T.
  • Journal Title: Parasitology International Volume: 65 Pages: 251-257
  • DOI: 10.1016/j.parint.2016.01.007.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Role of the tumor necrosis factor receptor-associated factor-type zinc finger domain containing protein 1 (TRAFD1) from the hard tick Haemaphysalis longicornis in immunity against bacterial infection. (2016)
  • Author(s): Takechi R, Galay RL, Matsuo T, Maeda H, Kusakisako K, Talactac MR, Mochizuki M, Fujisaki K, Tanaka T.
  • Journal Title: Ticks and Tick-borne diseases Volume: 7 Pages: 36-45
  • DOI: 10.1016/j.ttbdis.2015.08.002.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The vector potential of haemaphysalis longicornis ticks for babesia microti parasites under experimental condition (2015)
  • Author(s): Kusakisako K, Maeda H, Galay RL, Matsuo T, Tsujio M, Umemiya-Shirafuji R, Mochizuki M, Fujisaki K, Tanaka T
  • Journal Title: The Journal of protozoology research Volume: 25 Pages: 8-17
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] フタトゲチマダニ体内におけるBabesia ovata移行動態について (2016)
  • Author(s): 前田大輝, 八田岳士, 坪川大悟, 三上房子, 松林誠, 三好猛晴, 白藤（梅宮）梨可, 大久保和洋, 五十嵐郁男, 望月雅美, 藤崎幸蔵, 辻尚利, 田仲哲也
  • Organizer: 第85回日本寄生虫学会大会
  • Place of Presentation: 宮崎市民プラザ（宮崎県宮崎市）
  • Year and Date: 2016-03-18 – 2016-03-20
• [Presentation] ベクターマダニ体内におけるBabesia ovata増殖動態についての一考察 (2015)
  • Author(s): 前田大輝, 八田岳士, 松林誠, 三好猛晴, 白藤(梅宮)梨可, 大久保和洋, 五十嵐郁男, 辻尚利, 望月雅美, 藤崎幸蔵, 田仲哲也
  • Organizer: 第158回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 北里大学獣医学部（青森県十和田市）
  • Year and Date: 2015-09-07 – 2015-09-09