2014 Fiscal Year Annual Research Report
末梢神経障害性疼痛に伴う免疫系細胞脊髄内浸潤の意義
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14J06926
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
勇 昂一 京都大学, 薬学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 末梢神経障害 / アロディニア / 脊髄 / 骨髄由来細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は末梢神経損傷後に脊髄内に浸潤する骨髄由来細胞の同定を中心に解析を行った。
実験にはGFP陽性骨髄由来細胞をGFP陰性の野生型マウスに骨髄移植することで、末梢免疫系細胞だけにGFPを発現する骨髄キメラマウスを用いた。末梢神経を損傷すると神経損傷7日以降に、GFP陽性骨髄由来細胞の浸潤が著しく認められ、約半数がIba1(マクロファージの指標)陽性であることが確認された。しかしながら、マクロファージに発現することが知られている他の指標(MHC class IIやCD206)は陰性であり、T細胞の指標であるCD3も陰性であった。さらに、脊髄内に浸潤したGFP陽性細胞は樹状あるいは球状を示しており、樹状のGFP陽性細胞の多くがIba1陽性であったことから、未分化の骨髄由来細胞が脊髄内に浸潤しIba1陽性細胞に脊髄内で分化している可能性が示唆された。このことから、骨髄由来細胞の脊髄内浸潤を抑制できなくても、浸潤後の分化を制御できれば疼痛を減弱できると考えられる。浸潤抑制に関しては、白血球の遊走阻害作用を有するコルヒチンを用いた検討を行ったが、脊髄内Iba1陽性細胞への影響は認められなかった。
一方、実験で用いる骨髄キメラマウスでは作成過程で照射するガンマ線のためにガンマ線非照射マウスに比べ、血液脊髄関門が緩くなっており、神経損傷後の骨髄由来細胞の浸潤が生じやすくなることが懸念されている。しかしながら、神経損傷後の脊髄へのエバンスブルーの透過性にはキメラマウスと非照射マウスで差が認められず、血液脊髄関門を構成するタイトジャンクションプロテイン(ZO-1やOccludin)のmRNA発現にも変化は認められなかった。
これまで、神経障害性疼痛と非選択カチオンチャネルであるTRPM2の関連を報告したが、糖尿病性末梢神経障害や膝関節炎モデルへの寄与も認められた
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
神経損傷後の脊髄内に浸潤する骨髄由来細胞の同定に関して、種々のT細胞の指標を用いて免疫染色を行う予定であったが染色条件の確立に時間がかかっている。特に、複数の抗体を用いた多重免疫染色では、特定の抗体の染色に適した条件が、他の抗体の染色には不適な条件であることもあり、多数の条件検討が今後も必要になると考えられる。
骨髄由来細胞の脊髄内浸潤メカニズムに関して、多光子顕微鏡を使用したin vivoイメージングの条件検討を行う予定であったが、脊髄の露出に伴う出血やマウスの保定時に生じるわずかな振動のために、焦点を合わすことが非常に困難であり、1つの細胞の挙動をリアルタイムで追跡する条件の確立が難航している。
脊髄内のグリア細胞を標的として各種薬物を髄空内投与し、グリア細胞への影響と骨髄由来細胞の浸潤を検討しているが、カテーテル留置による脊髄への障害が大きく正確な評価には至っていない。
キメラマウスとガンマ線非照射マウスの比較に関して、血液脊髄関門のタイトジャンクション形成に関与する因子をmRNA発現だけでなくタンパク質レベルで検討する予定であったが、キメラマウスの生存率が当初は低く、実験に充分な数のキメラマウスを作成することができなかった。これに関しては現在改善しており、今後は実験に必要なキメラマウスの供給が充分に行えると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
神経損傷後に脊髄内浸潤した骨髄由来細胞の詳細な同定を継続する。また、神経損傷後の骨髄由来細胞の浸潤を抑制する目的で、白血球の遊走を制御する薬物や単球の遊走を促進すると考えられるケモカインの中和抗体等をキメラマウスに処置し、神経損傷後の脊髄内浸潤とアロディニアの病態形成について評価を行う予定である。薬物投与経路として髄腔内カテーテル留置を考えているがカテーテル留置による脊髄への障害も懸念されるので、カテーテルを留置しない髄腔内投与での検討も行う。
γ線照射骨髄キメラマウスとγ線非照射マウスとの比較検討に関しては、タイトジャンクション形成に関与する因子をmRNA発現だけでなく、タンパク質レベルでの発現量の比較も行う。
また、神経損傷後に損傷部位へと浸潤するマクロファージには炎症性M１マクロファージと抗炎症性M２マクロファージに分化することが知られているが、骨髄由来細胞の脊髄内浸潤を抑制するだけでなく、脊髄内に浸潤する細胞をM２マクロファージに分化させるあるいは浸潤した骨髄由来細胞の分化をM２様へと分化することができれば、中枢神経感作を抑制できると考えられる。今後はこのM２マクロファージの分化と脊髄内浸潤や脊髄内グリア間相互作用、中枢神経感作についても検討を行う予定である。
これまで浸潤の抑制やメカニズムについて検討を行ってきたが、臨床での状況を考えると、神経損傷後の処置で疼痛を改善することが望ましく、脊髄内に浸潤した骨髄由来細胞の分化を抑制あるいは抗炎症性へと分化させることが疼痛の改善につながれば、そのインパクトは非常に大きいと考えている。こうした細胞の分化に関して、in vivo実験だけでは分子レベルでの解明が難しいと考えられるが、現在in vitroでグリア間相互作用やT細胞とマクロファージの相互作用を評価できる系を考案中である。
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Research Products
(2 results)
