2014 Fiscal Year Annual Research Report
精子核リモデリングにおけるＨ３Ｋ９脱メチル化酵素 （ＪＭＪＤ１Ｃ）の機能解析
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14J07577
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
中島 龍介 慶應義塾大学, 医学研究科, 特別研究員(DC1)
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2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 精子形成 / ヒストン脱メチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エピゲノム制御の一翼を担うヒストン脱メチル化酵素遺伝子群の中で、内部細胞塊から配偶子形成に至る生殖細胞の分化過程において特徴的な発現変動を示すものとして、H3K9脱メチル化酵素遺伝子Jmjd1Cが着目された。そこでβgeo gene-trap(GT) ES細胞からのJmjd1C GTマウスを解析したところ、GTホモ型マウスは精子形成不全を示し、そのGT変異精巣では円形精子細胞からの精子完成期に顕著な組織学的異常が見られた。近年、類似の変異表現型が同族遺伝子のJmjd1Aでも報告され(Okada et al, Nature, 2007)、JMJD1Aの脱メチル化作用が精子核リモデリング遺伝子の発現促進に寄与することが示されている。以上の知見に基づいて、本研究はJMJD1CのH3K9脱メチル化制御及びその関連因子や標的遺伝子との相互関係を解明することを目的とし、これによって精子核リモデリングに関わるエピゲノム制御ネットワークの究明を目指す。
分子的相互作用を網羅的に探索するため、本年度はChIP (染色体免疫沈降)解析とIP(免疫沈降)解析を開始した。しかし、その途上にてJmjd1Cノックアウト(KO)変異に関する先行論文が報告された(Kuroki et al, BOD, 2013)。このKO変異は精子形成不全を示す点で一致するが、変異の原因が精子形成過程ではなく精子幹細胞の増殖維持にあるとする点において、本研究の知見とは一致しない。そのため、相違の原因究明を優先すべく計画内容の変更を行った。解析の結果、JMJD1Cは先行論文が示す精原細胞期だけでなく減数分裂後期にも特定の機能を持つことが確認され、２つ分化段階におけるJMJD1C機能の量的閾値の違いによって、GT精子細胞期における異常が顕在化する可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
後述(2)の検証実験を追加した計画変更を行ったため、本来の計画達成度には不足が生じた。なお、本年度の具体的研究成果は以下の通りである。
1.ChIP-Seq法による解析： JMJD1Cの標的遺伝子を同定するため、GTホモ型及び野生型精巣の精子形成細胞をDNA量別に選別し、1N(精子細胞), 2N (精原細胞), 4N(精母細胞)の各段階を精製後、その染色体試料についてJMJD1CおよびJMJD1A抗体を用いたChIP-Seq法を実施するとともに、それらの基質であるH3K9me2修飾に対する特異抗体を用いたChIP試料を調製した。これにより、精子形成期にJMJD1C/1Aの結合部位となる複数の遺伝子候補の情報が得られた。
2. Jmjd1C KOマウスとGTマウス表現型の相違 : 先行論文に示されたKOマウス表現型と本研究のGTマウス表現型の相違を検証し、以下の結果を得た。1)JMJD1C/β-geo発現を再検証した結果、抗原部位の異なる抗体を用いた場合、JMJD1Cは精子細胞期に強発現しており、精子細胞における機能を強く指示した。 2)生後４週間の過程で起こる第１波の精子形成は精子幹細胞に由来しない。この幼若期にKOマウスでの異常は示されていないが、GTマウスでは既に精子細胞の形態や配向性に異常が検出された。 3) GTホモ型精巣のJmjd1C mRNA及び蛋白質を高感度で再検討したところ、野生型の10%以下のレベルで全長型産物が検出された。その転写産物の検証によって、翻訳開始点上流のイントロンに挿入したβ-geo に起因する転写終止が完全に機能せず、一部に融合型mRNA前駆体の転写が起こることが判明した。このGT変異に起こるJMJD1C蛋白質の極低レベル発現が、精子細胞期に見られる異常形質の顕在化をもたらしたことが推察された。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.一般にヒストン修飾酵素は広範囲の発生段階や細胞種に発現し、かつ共通の酵素作用を持つ因子が多重に存在するため、発現特性から機能的特異性を特定することは難しい。Jmjd1Cの場合も、発現は初期胚から多様な成体組織に見られるのに対して、その機能欠損(KO, GT)による異常は精子形成細胞のみに現れた。また、JMJD1Cが精子幹細胞の増殖と精子細胞の成熟分化の両局面に特異的な機能的必要性を示すことは、２つの局面で異なる遺伝子群が標的になることによって、各段階特異的な細胞機能に異常が現れたものと推定される。本研究（前項１）で実施したChIP-Seq解析は精子細胞における標的遺伝子部位を探索すべく開始したものであるが、分子機能の全容解明には今後さらに精原・精母細胞を含めた網羅的かつ細密な部位探索の蓄積が必要とされる。
2. 先行論文が報告されたことにより、本研究の展開には大幅な変更が必要となった。先行報告との相違点を究明した成果として、差異の一因はGT変異に見られる(野生型に比して)10%以下に減少する低レベル発現にあると推定された。約50%の発現レベルを持つGTヘテロ体が正常な精子形成を示すことを考慮した場合、JMJD1C蛋白質の正常機能には量的閾値もしくは共役因子との量的均衡が極めて厳密に設定されている可能性が考えられる。
このような先行報告との対比を踏まえた上で、これまでの本研究成果を速やかに学術論文として公表することが求められる。そのため、次年度は第一に論文発表に向けて、従来成果の詳細を詰める検証作業を最優先に実施する。その進捗に応じて、上記(1)項目の進展あるいは新たな課題への取組みを検討する予定である。
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Research Products
(2 results)
