2014 Fiscal Year Annual Research Report
ポジティブ／ネガティブマーカーを用いたタンパク質分泌経路の進化工学
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14J08165
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
池 紘平 千葉大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | genetic selection / genetic switch / quorum-sensing / synthetic biology |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，マーカータンパク質が細胞内から分泌されたか否かを"数分の操作だけで"細胞死に対応づけることができるポジティブ/ネガティブ選択法を用いて，異種タンパク質の生産システムとして有望視されているTat分泌システムの分泌効率の向上をめざす．本年度は，機能選抜に利用するマーカー遺伝子の改良を行うとともに，Expression system (遺伝子スイッチ) の機能改良/多様化へと応用した。
ネガティブマーカー(hsvtk)とポジティブマーカー(aph or cat)とを融合したデュアルマーカーを作製し，マーカータンパク質を恒常的に発現する/しない細胞をネガティブ選択試薬(dP)，あるいはポジティブ選択試薬(kanamycin)で処理した時の生菌数を比較した。この結果，両選抜操作ともに~106もの選択効率を達成できることが分かった。そこで，デュアルマーカー(hsvtk::aph)をLuxRスイッチの制御化に配置するとともに，LuxRのoperator配列をランダム化し，luxRスイッチの機能を多様化したライブラリを作製した。作製したライブラリに対し，種々の条件でネガティブ/ポジティブ選択を行うことによって，非誘導時には漏出発現なく，誘導時の遺伝子発現プロファイルが多様な遺伝子スイッチシリーズを得た。
加えて，プロモータ(ptraI)改変およびtraR 遺伝子へのランダム変異導入と上記デュアルマーカーを利用した機能選抜を行うことにより，大腸菌内において，対応するプロモータの転写を活性化できないと言われてきたTraRスイッチの機能改変も達成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は，新たなセレクションマーカーを用いたセレクション法を確立した。この選択法は，従来のセレクション法に比べ，偽陽性が少なく，細胞内におけるマーカータンパク質の不在／存在(細胞内から分泌された／されていない状態に対応)と細胞の生死の対応付けを強固にするものである。この信頼正の高い機能選抜は，分泌システムの多世代にわたる進化工学の大幅な効率化をもたらすものと期待される。
また，本手法のテストランとして副次的に開発した二種の遺伝子スイッチ( 改良型Luxスイッチ/Traスイッチ)は，非誘導時の漏出発現が少なく，誘導試薬の量に応じて，標的遺伝子の発現量を任意に制御可能であることから、生物（工学）分野で愛用される発現制御なるものと期待される。これら成果は，フルペーパーとして投稿予定である。信頼できる手法を得たいま，分泌系の改良や遺伝子スイッチの遷移速度など，いままで試みられたことのない細胞機能の進化デザインに着手したところであり，その進捗状況は順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
２年目は，研究計画調書に記載した計画通り，Tat分泌システムの多世代にわたる実験室内進化を行う。また，そこで得られた分泌装置の生化学解析(分泌生産)およびシーケンス解析を行い，分泌効率向上に影響し得るアミノ酸部位などの特定を試みる。
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Research Products
(5 results)
