テルペンおよび前駆体合成酵素の活性進化

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J08173
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 岩嵜 美希 千葉大学, 大学院工学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: IspH / 進化工学 / ハイスループット・スクリーニング / テルペン

Outline of Annual Research Achievements

テルペンは香料、医薬品、農薬などとして広く利用される天然化合物群である。近年、有価テルペンを微生物に大量生産させる試みが盛んである。テルペンの前駆体であるプレニルニリン酸の供給を増やすと、テルペン生産性は向上する。大腸菌に構築されたテルペン合成経路は、ユビキノンやC55PPといった細胞増殖に必須のリソースの合成と、プレニルニリン酸消費において競合している。ゲラニオール合成酵素変異体 (GESM53) は、その高いGPP消費活性によって、ユビキノンやC55PPの欠乏による細胞増殖の阻害 (コロニー形成の阻害) を引き起こす。この現象を利用して、GPP生産性を高める遺伝型を「細胞増殖の有無によって選抜」できるハイスループットな手法を開発した。本年度は、本手法を用いて大腸菌のプレニルニリン酸合成経路 (MEP経路) の改良を試みた。
MEP経路を構成する様々な酵素の遺伝子を過剰発現させ，GESM53による細胞増殖阻害からの回復の程度を調べた。Idiやfarnesyl diphosphate synthase (FPPS)などの追加発現は、生菌率をほとんど100％回復させた。一方，MEP経路の最終ステップを担うIspHの過剰発現は生菌率の回復を示さなかった。そこで、IspHの遺伝子にランダムな変異を導入し、IspH変異体ライブラリを作成した。約5000 cloneのIspH変異体をGES発現株で選抜したところ、11 cloneのIspH変異体のみがコロニー形成能を有した。選抜されたIspH変異体をカロテノイド合成経路とともに大腸菌に導入し、FPPから合成されるカロテノイドの合成量を調べたところ、いずれも野生型のIspHに比べて高いカロテノイド生産性を示し、CxPP生産性が向上していることが示唆された。今後、取得したIspH変異体がテルペン生産性も向上させるか調査する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、プレニルニリン酸の供給能のハイスループット探索系を適用する、対象酵素および経路のライブラリを構築する予定であった。実際には、MEP経路のすべての酵素に対して細胞増殖に基づく評価をおこない、その中でも特に重要な酵素であると示唆されたIspH のライブラリを作製して機能選抜をおこない、その機能改良まで完了させた。
また、もう一つの計画であった前年度に取得したモノテルペン合成酵素のキャラクタリゼーションのための精製、生産物分析系の改良も進めた。

Strategy for Future Research Activity

テルペン合成酵素の進化工学には、所属研究室で開発した比色スクリーニングを用いてきた。文献調査の結果、テルペン合成酵素の活性にも「細胞増殖の有無に基づいて評価する」手法があり、この手法を改良して、高活性なテルペン合成酵素の探索に応用できる可能性があることがわかった。テルペン合成酵素およびその前駆体合成経路の改良という両輪を回すには、スクリーニング系のさらなるハイスループット化が有効である。来年度は、高活性なテルペン合成酵素の探索に応用できる「細胞増殖の有無に基づいて評価する」系の構築も試みたい。