2014 Fiscal Year Annual Research Report
ｎｃＲＮＡ／スプライシング因子を介した新規セントロメアサイレンシング機構の研究
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14J09699
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
牟田園 正敏 熊本大学, 自然科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | ヘテロクロマチン / セントロメア / 分裂酵母 / スプライシング / イントロン / non-coding RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は現在までの解析から、分裂酵母のスプライシング変異株prp14において、スプライシングの異常に加えて、セントロメア領域のヘテロクロマチン形成に異常を示すことを明らかにした。更に、Prp14pはRNAi機構を介したヘテロクロマチン形成に関わるCid12pと結合すること、セントロメアのdg領域から転写されるnon-coding RNAにmRNA型のイントロンが含まれることを明らかにしている。
そこで、本研究ではスプライシング因子が介在するヘテロクロマチン形成機構の解明のため、dg ncRNAが持つイントロンに着目し解析を行った。dg ncRNAイントロンを含むMini-chromosomeと含まないMini-chromosomeを用いてスプライシング因子Prp14p、RNAi因子Cid12pのdg ncRNAへの結合をRIP assayにより調べた。その結果、イントロンを除いた方ではPrp14p、Cid12pの結合が有意に減少していた。つまり、dg ncRNAイントロンを介して、スプライシング因子がRNAi因子を呼び込みヘテロクロマチン形成を促進するというモデルを強く支持する結果を得ることが出来た。また、dgイントロンの機能に迫る解析として、スプライシング部位に変異を導入した際のH3K9me2修飾を調べた。5’splice site, Branch point, 3’splice siteに変異を導入し、スプライシングが起こらないような状態にした場合、H3K9me2修飾の顕著な減少が見られた。つまり、dgイントロンのスプライシング反応自体がセントロメアのヘテロクロマチン化に重要であるという新たな知見を得ることが出来た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
年次計画の１つ目に掲げている「dgイントロン上に形成される複合体の同定」を目的とした解析において、Prp14pとCid12pがdg ncRNAイントロン上に結合することをRIP assayにより明らかにした。また、dgイントロンの機能に迫る解析として、スプライシング部位に変異を導入したプラスミドやイントロン領域・イントロン前方領域を置換したプラスミドを作成し解析を行い、dgイントロンのスプライシング反応がセントロメアのヘテロクロマチン化に重要であることを明らかにした。
また、これまでの解析から、RNAi機構を仲介しないセントラルコア領域でも、prp14変異株でクロマチンサイレンシングが異常を示すことが分かっている。これに関する年次計画の3つ目として「Prp14pと遺伝学的に相互作用する因子の網羅的探索」を掲げた。UV照射により新たに変異を導入し、セントラルコア領域のサイレンシングが回復する株をスクリーニングにより17クローン単離した。更に、prp14変異のマルチコピーサプレッサーの単離を試み、現在までに選択培地で生育可能な候補株を114クローン得ることが出来た。このことは、今後の解析を進める上で大きな前進である。以上の結果から、(2)の区分と自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
dg ncRNAイントロン上にPrp14pやCid12pが結合していることは分かった。しかし、他にどのような因子が結合しているのかは明らかになっていない。そこで、dg ncRNA上に結合している因子を、RNA複合体をPull-downしMS解析により同定する。
また、prp14変異株を用いたセントラルコア領域のサイレンシングに関する解析において、サプレッサースクリーニングにより単離した遺伝子の同定を行い、同定した因子とPrp14pが複合体を作るかどうかIPにより調べる。また、同定した因子のセントラルコア領域におけるサイレンシングへの関与をノックダウンなどにより解析する。
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Research Products
(6 results)
