ＵＰＦ１依存的な新規ＲＮＡ分解を介したｍＲＮＡの量的制御及びその生理機能の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14J11190
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 今町 直登 東京大学, 大学院薬学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2014-04-25 – 2017-03-31
• Keywords: RNA分解 / 次世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

まず、UPF1タンパク質をノックダウンしたときのRNAの分解速度の変動、及びUPF1とRNAの物理的な相互作用の有無を同時解析することにより、UPF1標的RNAとして246遺伝子を同定した。
次に、リン酸化UPF1のゲノムワイドなRNAフットプリントデータを利用することにより、UPF1を介したRNA分解経路における基質認識部位の同定を試みた。まず、上記の次世代シーケンサーから得られたシークエンスリードは他の領域と比較してRNAの3'UTR領域に比較的多くマッピングされることから、リン酸化したUPF1タンパク質はRNAの3'UTR領域に主に結合していることがわかった。そこで、同定した246種のUPF1標的遺伝子の3'UTR領域に存在するリン酸化UPF1の結合部位のRNA配列からモチーフ配列をMEMEを用いて予測した。その結果、CUGを中心としたモチーフ配列がリン酸化されたUPF1の結合配列として予測された。
さらに、上記で同定されたリン酸化UPF1結合配列を含むUPF1標的RNAの3’UTR配列がRNAを不安定化し、UPF1を介したRNA分解を誘導するかどうか検証した。UPF1標的遺伝子として同定されたGADD45B mRNAの（上述の結合配列を含む）3'UTR配列を組み込んだレポーターRNAをHeLa細胞中に発現させたところ、レポーターRNAの不安定化が確認された。このことから、3'UTR配列中にRNA分解促進配列が存在していることが確認された。また、UPF1をノックダウンしたHeLa細胞において、上記のレポーターRNAの不安定化はキャンセルされた。さらに、リン酸化UPF1の結合部位を欠いた3'UTR配列を組み込んだレポーターRNAでは上記で見られたRNAの不安定化が部分的にキャンセルされた。以上の結果から、リン酸化UPF1の結合配列を含むUPF1標的RNAの3'UTRが、UPF1を介したRNA分解経路における基質認識に関与していることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題の当初研究目的の達成度については、期待したほどではないがある程度の進展が見られたと判断している。
ゲノムワイドな分解測定法であるBRIC-seq法とRNA結合タンパク質との相互作用を確認するRIP-seqを組み合わせることによりUPF1標的遺伝子を同定し、さらには、UPF1のフットプリントデータを活用することにより、UPF1標的mRNAの3’UTR配列中に存在するシス因子を予測することができた。
一方で、UPF1を介したRNA分解経路における基質認識の特異性を規定している他のRNA結合タンパク質の同定を行う目的で、UPF1を介したRNA分解経路におけるシス因子を含んだRNA配列をベイトにして質量分析（MS解析）を実施したが、UPF1と共役して標的mRNAに結合する新規のRNA結合タンパク質を同定するに至らなかった。また、昨年度中にUPF1を介したRNA分解経路がどのような生理機能の調節に働いているかどうかについて、新しい知見・手がかりを得ることができなかった。
上記の点から、研究の到達度として期待したほどではないがある程度の進展が見られたと判断した。

Strategy for Future Research Activity

昨年度までの研究から、同定したUPF1標的遺伝子の3’UTR配列中に含まれるCUG配列を中心とするGC-richな配列がシス因子として機能していることがわかっている。また、DMPK mRNAの3’UTR配列CUGトリプレットリピートの過伸長によって起こる１型筋ジストロフィー症の患者において、今回同定されたUPF1標的遺伝子の発現量が上昇傾向にあることがわかっている。そこで以上の結果から、１型筋ジストロフィー症（DM1）の患者においてUPF1を介したRNA分解経路が何かしらのメカニズムにより抑制されていると考えた。
先行研究によって、DM1においてCUGリピートの過伸長を起こしたDMPK mRNAは核で凝集体を形成することがわかっていることから、その凝集体にUPF1がトラップされることにより、本来、正常組織においてUPF1を介して分解を受けているUPF1標的mRNAが安定化しているという仮説と、DM1においてUPF1のタンパク質量の低下もしくはリン酸化の抑制などを介してUPF1を介したRNA分解経路が抑制されている仮説を立て、それらを検証する実験を本年度中に実施する予定である。これにより、筋ジストロフィー症とUPF1を介したRNA分解経路の関係性を明らかにするとともに、筋ジストロフィー症における新たな病態メカニズムを明らかにすることを本年度における研究課題とする。

Research Products

• [Journal Article] Genome-wide analysis of long noncoding RNA turnover (2015)
  • Author(s): Tani H, Imamachi N, Mizutani R, Imamura K, Kwon Y, Miyazaki S, Maekawa S, Suzuki Y, Akimitsu N
  • Journal Title: Methods Mol Biol Volume: 1262 Pages: 305-20
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-2253-6_19
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Analysis of RNA decay factor mediated RNA stability contributions on RNA abundance (2015)
  • Author(s): Maekawa S, Imamachi N, Irie T, Tani H, Matsumoto K, Mizutani R, Imamura K, Kakeda M, Yada T, Sugano S, Suzuki Y, Akimitsu N
  • Journal Title: BMC Genomics Volume: 16 Pages: 1471-2164
  • DOI: 10.1186/s12864-015-1358-y
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Long noncoding RNA NEAT1-dependent SFPQ relocation from promoter region to paraspeckle mediates IL8 expression upon immune stimuli (2014)
  • Author(s): Imamura K, Imamachi N, Akizuki G, Kumakura M, Kawaguchi A, Nagata K, Kato A, Kawaguchi Y, Sato H, Yoneda M, Kai C, Yada T, Suzuki Y, Yamada T, Ozawa T, Kaneki K, Inoue T, Kobayashi M, Kodama T, Wada Y, Sekimizu K, Akimitsu N
  • Journal Title: Mol Cell Volume: 54 Pages: 393-406
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2014.01.009
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] The identification of ceRNA crosstalk in human cancer (2015)
  • Author(s): Imamachi N and Akimitsu N
  • Organizer: International Symposium on Genome Science 2015
  • Place of Presentation: 東京, Hitotsubashi Hall,National Center of Sciences Building
  • Year and Date: 2015-01-20 – 2015-01-20
• [Presentation] ゲノムワイドなRNA分解測定法を利用したUPF1標的遺伝子および基質認識部位の予測 (2014)
  • Author(s): 今町 直登, 谷 英典, 入江 拓磨, 鈴木 穣, 秋光 信佳
  • Organizer: 第13回次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2014
  • Place of Presentation: 富山, 富山国際会議場多目的会議室
  • Year and Date: 2014-09-20 – 2014-09-20
• [Presentation] ゲノムワイドなRNA分解測定法を利用した UPF1標的遺伝子および基質認識部位の予測 (2014)
  • Author(s): 今町 直登, 谷 英典, 今村 克俊, 入江 拓磨, 鈴木 穣, 秋光 信佳
  • Organizer: ゲノム支援拡大班会議
  • Place of Presentation: 神戸, ポートピアホテル
  • Year and Date: 2014-08-20 – 2014-08-20
• [Presentation] Identification of cis-regulatory elements within UPF1 target transcripts (2014)
  • Author(s): Imamachi N, Tani H, Mizutani R, Imamura K, Irie T, Suzuki Y and Akimitsu N
  • Organizer: The 9th FASEB meeting: Post-Transcriptional Control of Gene Expression: Mechanism of mRNA Decay
  • Place of Presentation: Yellowstone National Park hotel, Big Sky, Montana, USA
  • Year and Date: 2014-06-08 – 2014-06-08
• [Presentation] Identification of cis-regulatory elements within UPF1 target transcripts (2014)
  • Author(s): Imamachi N, Tani H, Mizutani R, Imamura K, Irie T, Suzuki Y and Akimitsu N
  • Organizer: The 19th Annual Meeting of the RNA Society
  • Place of Presentation: Centre des Congres de Quebec, Quebec City, Canada
  • Year and Date: 2014-06-07 – 2014-06-07
• [Presentation] ゲノムワイドなRNA分解測定法を利用したUPF1標的遺伝子および基質認識部位の予測 (2014)
  • Author(s): 今町 直登, 谷 英典, 入江 拓磨, 鈴木 穣, 秋光 信佳
  • Organizer: 第14回 東京大学生命科学シンポジウム BIO UT
  • Place of Presentation: 東京, 伊藤国際学術研究センター
  • Year and Date: 2014-04-26 – 2014-04-26