2014 Fiscal Year Annual Research Report
脂肪滴一重膜におけるリン脂質脂肪酸鎖の生物学的意義の解明
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14J12201
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| Research Institution | Ochanomizu University |
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Principal Investigator |
有澤 琴子 お茶の水女子大学, 人間文化創成科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2014-04-25 – 2017-03-31
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| Keywords | 脂肪滴 / 飽和・不飽和脂肪酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 肥大化脂肪滴モデル細胞の作製
肥大化脂肪滴のモデルとなる細胞を作製するために、脂肪滴に局在し脂肪分解を抑制するPerilipin1と、脂肪滴を融合させるFSP27をそれぞれNIH3T3細胞に安定発現させた（Perilipin細胞、FSP27細胞）。それぞれの細胞にオレイン酸1 mMを添加すると、FSP27細胞ではmock細胞やPerilipin細胞と比べて大きな脂肪滴が観察された。
2. 脂肪滴膜リン脂質の脂質解析
小型および大型脂肪滴の脂肪滴膜リン脂質の脂肪酸組成の特徴を調べるため、mock細胞の小型脂肪滴とFSP27細胞の大型脂肪滴をショ糖密度勾配超遠心で分画し、脂肪滴膜のホスファチジルコリンの脂肪酸組成を測定した。FSP27細胞から得られた大型脂肪滴は、mock細胞の小型脂肪滴と比較して飽和脂肪酸が多く、不飽和脂肪酸が少ないという結果が得られた。これは、以前に報告した3T3-L1細胞の肥大化脂肪滴で見られた傾向とは逆の結果であり、脂肪滴膜リン脂質脂肪酸の不飽和度と脂肪滴のサイズは必ずしも相関しないということが示唆された。
3. 脂肪滴の脂質抽出物を用いた脂肪滴様エマルションの再構成
大型の脂肪滴膜に特異的なリン脂質やその脂肪酸鎖などの脂質組成は、大型脂肪滴の形成や安定化に有利な生物物理的性質を持つ可能性がある。脂肪滴の脂質組成自身がそのサイズを規定する可能性を検討するために、細胞より得られた小型・大型脂肪滴の脂質抽出物を用いて試験管内で脂肪滴様のO/W型エマルションを再構成し、そのサイズ・数を評価した。FSP27細胞の脂肪滴脂質抽出物からは細胞内と同程度のサイズの大型エマルションが得られたのに対して、mock細胞由来では小型のエマルションしか見られなかった。この結果より、大型脂肪滴を構成している脂質組成そのものが、大型脂肪滴を形成しやすい性質を持つことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は脂肪滴の肥大化に関わる膜タンパク質の過剰発現細胞株を作製し、その中で脂肪滴融合タンパク質FSP27を過剰発現させた細胞において、大型脂肪滴が多く存在することを示した。これらの細胞を用いた実験結果より、脂肪滴膜の脂肪酸の不飽和度と脂肪滴サイズとの相関は低いことが示唆された。しかし、脂肪酸以外の膜脂質と脂肪滴サイズとの関連性についても検討を行うため、他の脂質の測定系も確立し、現在膜脂質の詳細な解析を行ってきた。さらに、脂肪滴の脂質抽出物を用いた脂肪滴様エマルションの実験より、大型脂肪滴を構成している脂質組成そのものが大型脂肪滴を形成しやすい性質を有していることを明らかにした。これらの研究結果は、脂肪滴の脂質組成が肥大化脂肪滴の物理的性質を担っていることを示す新たな知見であり、来年度の研究に繋がる成果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
脂肪滴の肥大化において重要である脂質組成を明らかにし、脂肪滴膜の脂質組成 (特に脂肪酸鎖）が脂肪滴のサイズや脂肪滴へのタンパク局在に与える影響を調べる。
1. 脂肪滴膜の脂質組成の定量解析：3T3-L1脂肪細胞および、脂肪滴肥大化に関わるPerilipin1やFSP27を遺伝子導入したNIH3T3細胞を主に用いて、脂肪滴膜のリン脂質脂肪酸組成および、他の脂質組成の基礎データを収集する。脂肪滴膜のリン脂質（特にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン）、コレステロールを定量し、これらのデータと、これまでに得たリン脂質脂肪酸組成のデータを統合して膜の物理的性質について考察する。
2. 脂肪滴様エマルションを用いた評価：細胞内の大型脂肪滴由来の脂質抽出物を用いて試験管内でエマルションを再構成すると、大型のエマルションが得られることが平成26年度の研究で示唆された。脂質を種々の組成で混合し、エマルションを再構成させてそのサイズや数を評価することで、大型脂肪滴の形成に必須の脂質組成を明らかにする。
3. 脂肪滴膜の脂質組成と脂肪滴膜タンパク質局在の関連性：異なる脂質組成を持つ脂肪滴様エマルションに対して脂肪滴膜タンパク質の局在が変化するかを調べる。まずは脂肪滴の成熟段階に応じて脂肪滴への局在が変化することが知られているPerilipin1をターゲットとし、Perilipin1タンパク質と脂肪滴様エマルションを試験管内で反応させ、エマルションに対する結合能を評価する。評価はPerilipin抗体を用いたWestern blottingおよびGFP-Perilipinを用いた蛍光観察にて行う。得られた結果を元に、脂肪滴膜の脂質組成や脂肪滴サイズとタンパク質局在の関連性を検討する。
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Research Products
(3 results)
